根皮苷對雌性果蠅壽命的影響及其作用機(jī)制

趙 江，陳 純，韓曉東，劉素穩(wěn)，馬 娜,4，王 浩,*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津津酒集團(tuán)，天津 300131；3.河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島　066600；4.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津　300457）

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根皮苷對雌性果蠅壽命的影響及其作用機(jī)制

趙 江1，陳 純1，韓曉東2，劉素穩(wěn)3，馬 娜1,4，王 浩1,*

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2.天津津酒集團(tuán)，天津 300131；
3.河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院，河北 秦皇島066600；4.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

摘 要：目的：研究根皮苷（phloridzin）對雌性果蠅壽命的影響并探究其延緩果蠅衰老的分子機(jī)制。方法：在果蠅壽命實(shí)驗(yàn)中，采用2 日齡雌性果蠅作為研究對象，在其培養(yǎng)基中分別加入0、0.5、2.0、5.0 mg/mL根皮苷進(jìn)行培養(yǎng)，直至果蠅全部死亡， 計(jì)算果蠅的平均壽命和最長壽命； 通過白草枯和雙氧水急性實(shí)驗(yàn)測定根皮苷對果蠅氧化應(yīng)激損傷的影響；試劑盒法測定果蠅體內(nèi)抗氧化酶活力；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測抗氧化基因表達(dá)水平。結(jié)果：2.0、5.0 mg/mL根皮苷可以顯著延長果蠅的平均壽命和最長壽命（P＜0.05）；根皮苷能夠?qū)Π俨菘莺碗p氧水造成的雌性果蠅氧化應(yīng)激損傷起到有效保護(hù)作用；添加 5.0 mg/mL根皮苷 可以極顯著提高Cu/Zn-超氧化物歧化酶（superoxide dism utase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力（P＜0.01），極顯著降低丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量（P＜0.01）；添加5.0 mg/mL根皮苷可以極顯著上調(diào)Cu/Zn-SOD及CAT mRNA表達(dá)水平（P＜0.01）。結(jié)論：根皮苷能夠延緩雌性果蠅衰老，且具有抗氧化作用，這可能與其調(diào)控抗氧化基因的表達(dá)水平相關(guān)。

關(guān)鍵詞：果蠅；根皮苷；壽命；抗氧化；酶活力；基因表達(dá)

根皮苷（phlorizin）屬于二氫查爾酮根皮素的糖苷衍生物[1-2]，在蘋果樹的根、皮、嫩葉以及多穗柯甜茶中含量比較豐富[3-4]。馮天艷等[5]研究發(fā)現(xiàn)根皮苷能顯著抑制由四氯化碳（CCl4）引起的小鼠自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，顯著提高機(jī)體的抗氧化能力。Rezk等[6]研究發(fā)現(xiàn)根皮素能有效清除過氧亞硝基陰離子和抑制脂質(zhì)過氧化。Vasantha Rupasinghe等[7]研究發(fā)現(xiàn)根皮苷的抗氧化活性強(qiáng)于VE，可以抑制多元不飽和脂肪酸的氧化。根皮苷具有抗氧化性，能夠顯著延長酵母菌的壽命，其在延緩衰老及研究抗衰老藥物方面引起了廣泛關(guān)注[8]。

果蠅（Drosoph ila melanogaster）具有與人類十分相似的衰老基因[9-10]，因此常被用作衰老生物模型。根皮苷具有多種生物活性，如調(diào) 節(jié)血壓、保護(hù)心臟、降血脂[11]、清除自由基[6-7]等，是藥用植物中主要活性成分之一，因而已廣泛運(yùn)用于醫(yī)藥、化妝品、食品、植物組織培養(yǎng)等領(lǐng)域。然而，國內(nèi)對于根皮苷抗氧化性的研究較少，其作用機(jī)理尚不明確。本實(shí)驗(yàn)以雌性黑腹果蠅為模式生物，研究根皮苷對果蠅壽命、氧化應(yīng)激損傷、體內(nèi)抗氧化酶活力及丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的影響，并從分子水平研究根皮苷對抗氧化相關(guān)基因超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）及methuselah（MTH，一種長壽基因）mRNA表達(dá)水平的影響。

1　材料與方法

1.1材料、動(dòng)物與試劑

根皮苷（純度95%），由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供。

Oregon K野生型雌性黑腹果蠅，由天津科技大學(xué)食品添加劑與營養(yǎng)調(diào)控研究室提供。

分型SOD（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、總SOD）試劑盒、CAT試劑盒、MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green日本TaKaRa公司。

1.2儀器與設(shè)備

UVmini-1240紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；MyiQ2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國Bio-Rad公司；HWS-850智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3方法

1.3.1 果蠅培養(yǎng)基的配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蒸餾水750 mL、玉米粉72 g、葡萄糖72 g、酵母粉10 g、瓊脂粉6 g、防腐劑（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%對羥基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液）40 mL，小火加熱并充分?jǐn)嚢杌靹蛑镰傊耆芑；鸷罅⒓捶盅b到潔凈的果蠅培養(yǎng)試管中，培養(yǎng)基厚度約為1.0 cm。

給藥培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.5、2.0、5.0 mg/mL根皮苷。

1.3.2 果蠅壽命實(shí)驗(yàn)

收集2 日齡Oregon K野生型雌性黑腹果蠅800 只，隨機(jī)分為4 組，每組10 管，每管20 只，培養(yǎng)在溫度（25±1）℃，相對濕度50%～60%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)。果蠅管內(nèi)注入定量培養(yǎng)基，對照組果蠅飼喂基礎(chǔ)培養(yǎng)基，給藥組果蠅飼喂給藥培養(yǎng)基。保鮮膜封口培養(yǎng)果蠅，并留呼吸孔，每3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)觀察果蠅的生存狀況，記錄果蠅死亡數(shù)量，直至果蠅全部死亡。最后統(tǒng)計(jì)果蠅的平均壽命和最長壽命（每組最后存活的20 只果蠅的平均壽命）。

果蠅體質(zhì)量的測定：收集40 日齡果蠅，禁食2 h后，CO2麻醉放于EP管中，每管20 只，稱質(zhì)量，分別計(jì)算各組果蠅的平均體質(zhì)量。

1.3.3 果蠅急性氧化應(yīng)激損傷實(shí)驗(yàn)

飼喂方法同壽命實(shí)驗(yàn)，收集給藥25 日齡果蠅，禁食2 h，CO2麻醉導(dǎo)入干凈無培養(yǎng)基的果蠅培養(yǎng)試管內(nèi)，用濾紙條沾少許含30% H2O2的6%葡萄糖水溶液插入果蠅管內(nèi)，保證濾紙全部浸潤且不會(huì)有液滴流下，每2 h記錄果蠅死亡數(shù)，直至果蠅全部死亡，期間每隔4 h用注射器補(bǔ)給適量的H2O2液體保證濾紙條濕潤。同樣用20 mmol/L百草枯的6%葡萄糖水溶液替代濾紙條沾取的H2O2溶液，其余操作步驟相同，研究根皮苷對H2O2和百草枯所造成的果蠅急性氧化應(yīng)激損傷的影響。

1.3.4 果蠅抗氧化酶活力和抗氧化基因表達(dá)水平的測定

果蠅培養(yǎng)同壽命實(shí)驗(yàn)方法，收集40 日齡果蠅，禁食2 h后，CO2麻醉放于EP管中，每管20 只，稱質(zhì)量，并進(jìn)行平均體質(zhì)量的計(jì)算，存放于－80 ℃進(jìn)行后續(xù)酶活力和基因表達(dá)的測定。冰浴條件下，按照m（果蠅體質(zhì)量）∶m（生理鹽水）＝1∶49注入生理鹽水并用玻璃勻漿器勻漿，4 ℃、2 500 r/min離心20 min，收集上清液測定SOD酶活力（黃嘌呤氧化酶法）、CAT酶活力（可見 光法）、蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)法）及MDA含量（硫代巴比妥酸法）。加入Trizol液氮研磨果蠅，離心得到RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。Real-time PCR法檢測抗氧化相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1　果蠅抗氧化基因PCR引物Table 1 PPCR primers for the detection of mRNA expression of antioxidant genes in Drosophila melanogaster

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行分析，通過方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)表示為±s。

2　結(jié)果與分析

2.1根皮苷對雌性果蠅壽命的影響

如表2和圖1所示，根皮苷對果蠅體質(zhì)量無明顯影響，各組間差異不顯著（P＞0.05）。給藥組果蠅的平均壽命及最長壽命均高于對照組，且呈劑量依賴關(guān)系。其中5.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅的平均壽命延長了16.3% （P＜0.05），最長壽命延長了12.4%（P＜0.01）。

表2　根皮苷對雌性果蠅體質(zhì)量和壽命的影響（±s，n＝220000）Table 2 Effect of phlorizin on body weight and lifespan in female Drosophila melanogaster ((±s, n = 20000))

表2　根皮苷對雌性果蠅體質(zhì)量和壽命的影響（±s，n＝220000）Table 2 Effect of phlorizin on body weight and lifespan in female Drosophila melanogaster ((±s, n = 20000))

注：*.與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

根皮苷劑量/（mg/mL）　平均體質(zhì)量/μg　平均壽命/d　最長壽命/d 0（對照組）　1 126.83±13.20　51.02±1.31　83.63±1.56 0.5　1 124.19±12.30　52.25±1.43　86.25±2.65 2.0　1 119.14±8.80　57.04±1.28*　92.34±1.05* 5.0　1 119.79±6.20　59.36±1.49*　94.00±1.64**

圖1　雌性果蠅壽命曲線Fig.1 Lifespan curves of female Drosophila melanogaster

2.2根皮苷對雙氧水和百草枯所致雌性果蠅急性氧化應(yīng)激損傷的影響

圖2　根皮苷對急性氧化應(yīng)激損傷雌性果蠅的影響Fig.2 Effect of phlorizin on oxidative stress-induced damage in female Drosophila melanogaster

如圖2a所示，飼喂根皮苷的雌性果蠅體內(nèi)清除H2O2自由基的能力顯著提高，0.5、2.0、5.0 mg/mL根皮苷組果蠅的平均存活時(shí)間較對照組分別延長了4.0%、17.4%和

23.9%，最高存活時(shí)間延長了3.9%、13.6%和18.7%。飼喂根皮苷的雌性果蠅抵抗百草枯氧化應(yīng)激損傷的能力亦顯著提高（圖2b），0.5、2.0、5.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅的平均存活時(shí)間較對照組分別延長了3.5%、10.7%和17.2%，最高存活時(shí)間延長了4.2%、12.7%和18.9%。

2.3根皮苷對雌性果蠅體內(nèi)SOD、CAT酶活力和mRNA表達(dá)及MDA含量的影響

圖3　根皮苷對雌性果蠅體內(nèi)Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT酶活力和mRNA表達(dá)以及MDA含量的影響Fig.3 Effect of phlorizin on Cu/Zn-SOD, Mn-SOD and CAT activities, mRNA expression and MDA content in female Drosophila melanogaster

如圖3所示，與對照組相比，2.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅體內(nèi)Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT酶活力顯著升高（P＜0.05），5.0 mg/mL根皮苷組Cu/Zn-SOD、CAT酶活力極顯著升高（P＜0.01）；2.0 mg/mL和5.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅體內(nèi)MDA水平極顯著降低（P＜0.01），且效果呈劑量依賴關(guān)系。與對照組相比，2.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅體內(nèi)Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），5.0 mg/mL根皮苷組Cu/Zn-SOD、CAT mRNA 表達(dá)水平極顯著上調(diào)（P＜0.01）。給藥組雌性果蠅體內(nèi)MTH mRNA表達(dá)水平隨根皮苷劑量增加呈下調(diào)趨勢，其中5.0 mg/mL根皮苷組較對照組顯著下調(diào)（P＜0.05）。

3　討 論

飼喂根皮苷后，雌性果蠅的平均壽命和最長壽命均高于對照組，其中2.0、5.0 mg/mL根皮苷組較對照組雌性果蠅平均壽命及最長壽命均顯著延長（P＜0.05）；百草枯在細(xì)胞內(nèi)活化產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2－·）與H2O2產(chǎn)生的羥自由基（?OH）會(huì)誘導(dǎo)雌性果蠅產(chǎn)生急性氧化應(yīng)激損傷。結(jié)果表明，根皮苷可以有效延長雌性果蠅的壽命以及減弱由H2O2和百草枯引起的急性氧化應(yīng)激損傷。

抗氧化酶活力測定結(jié)果顯示，給藥組雌性果蠅體內(nèi)SOD、CAT酶活力比對照組明顯提高，MDA含量較對照組明顯降低。SOD和CAT是生物體內(nèi)清除活性氧的主要酶，這兩種酶相偶聯(lián)可以清除體內(nèi)O2－·和?OH等活性氧，因此SOD和CAT的活力水平間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力[12-13]，而MDA是自由基作用于不飽和脂肪酸而產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，通常作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)[14-15]。Cui Xiaojing等[16]通過組織培養(yǎng)的方法研究發(fā)現(xiàn)根皮苷能夠有效改善西府海棠根系保護(hù)酶的活性，包括SOD、過氧化物酶（peroxidase，POD）、CAT等，并顯著降低MDA含量。董華強(qiáng)等[11]從甜茶多穗柯中制備并分離得到根皮苷，并證明用根皮苷灌胃糖尿病模型小鼠可以有效地降低小鼠血糖水平和提高抗氧化能力。根皮苷可以淬滅自由基和單線態(tài)氧[15,17]，防止脂質(zhì)過氧化和DNA氧化損傷。根皮苷也可以有效減少大鼠肝細(xì)胞線粒體體外脂質(zhì)過氧化，有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS＋·）等過量自由基[18-19]。

Real-time PCR測定結(jié)果顯示，雌性果蠅體內(nèi)抗氧化相關(guān)基因SOD、CAT等mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.05），這與果蠅體內(nèi)酶活力升高的趨勢相一致。Tolmasoff等[20]報(bào)道了SOD的活性與靈長類動(dòng)物的壽命相關(guān)，研究表明超表達(dá)Cu/Zn-SOD和CAT的轉(zhuǎn)基因果蠅壽命比野生型長34%[21]，而單獨(dú)超表達(dá)CAT也能延長鼠科動(dòng)物的壽命[22]。MTH mRNA表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢，Baldal等[23]的研究表明敲除MTH內(nèi)源性配體基因或者過表達(dá)MTH受體的肽類拮抗劑均能延長果蠅的壽命。這與Rezk[6]和Lee[19]等研究發(fā)現(xiàn)蘋果多酚和茶黃素等可以有效提高果蠅體內(nèi)SOD、CAT等抗氧化酶相關(guān)基因表達(dá)水平、下調(diào)MTH表達(dá)水平，增強(qiáng)果蠅體內(nèi)抗氧化酶活力，有效延長果蠅壽命的結(jié)果相一致。

根皮苷是蘋果含有的特征酚類物質(zhì)，多以糖苷的形式存在[24-25]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明根皮苷具有抗氧化[1]等生理功效。自由基學(xué)說是目前公認(rèn)的衰老學(xué)說之一，自由基對細(xì)胞的各種成分和結(jié)構(gòu)都可產(chǎn)生損傷效應(yīng)，這些效應(yīng)的累積勢必造成細(xì)胞功能的減退，可以說衰老是自由基損傷性效應(yīng)的綜合結(jié)果。機(jī)體的抗氧化作用可保持自由基的產(chǎn)生與消除的平衡，對預(yù)防疾病與抗衰老等有重要意義。根皮苷具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能夠顯著提高雌性果蠅的抗氧化能力，其機(jī)制很可能與根皮苷清除自由基、提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性以及調(diào)控抗氧化基因mRNA的表達(dá)水平有關(guān)，但其具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Phloridzin on Life Span of Female Drosophila melanogaster and Its Underlying Mechanism

ZHAO Jiang1, CHEN Chun1, HAN Xiaodong2, LIU Suwen3, MA Na1,4, WANG Hao1,*

(1. School of Food Engineering and Biological Technology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457; 2. Tianjin Jinjiu Group Co. Ltd., Tianjin 300131, China; 3. College of Food Science and Technology, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066600; 4. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457)

Abstract:Objective: To explore the effect of phlorizin on lifespan in female Drosophila melanogaster and its underlying mechanism. Methods: Two-day-old flies were reared in media containing 0, 0.5, 2.0 and 5.0 mg/mL phlorizin until they all died, and then the longest lifespan and mean lifespan were calculated. By paraquat and hydrogen peroxide acute experiments, the effect of phlorizin on oxidative stress injury in Drosophila melanogaster was determined. The antioxidant capacity of phlorizin was evaluated by the activities of superoxide dismutase (T-SOD and Cu/Zn-SOD), catalase (CAT) and malondialdehyde (MDA) content in fruit flies. Re al-time PCR was used to detect the expression of antioxidant genes. Results: Dietary addition of phlorizin could prolong the lifespan of Drosophila melanogaster (especially at 2.0, 5.0 mg/mL, P < 0.05). The Cu/Zn-SOD and CAT activities were significantly increased and MDA content was significantly decreased by dietary supplementation of 5.0 mg/mL phlorizin (P < 0.01). Moreover, a significant increa se in Cu/Zn-SOD and CAT mRNA expression (P < 0.01) was found. Conclusion: The anti-aging and antioxidant acti v ity of phlorizin is most likely related to the regulation of antioxidant gene expression.

Key words:Drosophila melanogaste; phlorizin; lifespan; antioxidant; enzyme activity; gene expression

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507031

中圖分類號：TS201.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0167-05

*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，主要從事食品營養(yǎng)學(xué)研究。E-mail：wanghao@tust.edu.cn

作者簡介：趙江（1963—），男，研究員，碩士，主要從事食品營養(yǎng)學(xué)研究。E-mail：tozjmail@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201322）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B05）；天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20100609）；天津科技大學(xué)行業(yè)卓越人才實(shí)驗(yàn)班專項(xiàng)（1314A216）

收稿日期：2014-05-30