果蔬生防菌葡萄有孢漢遜酵母CM2糖蜜培養基的優化

蔡子康，王曉霞，秦曉杰，楊 蓉，司琳媛，肖紅梅*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

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果蔬生防菌葡萄有孢漢遜酵母CM2糖蜜培養基的優化

蔡子康，王曉霞，秦曉杰，楊 蓉，司琳媛，肖紅梅*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

摘 要：以葡萄有孢漢遜酵母CM2為研究對象，細胞生物量為測定指標，利用甘蔗糖蜜作為發酵原料，對糖蜜培養基的優化進行較為全面的探討。采用煮沸法、磷酸法、硫酸法、活性炭法、亞鐵氰化鉀法對糖蜜進行預處理，結果表明硫酸處理法優于其他處理方法。通過單因素試驗研究糖蜜質量濃度、氮源及其添加量、初始pH值、磷酸鹽、硫酸鎂、氯化鈉等培養基組分對CM2生長的影響；采用Plackett-Burman試驗設計、最陡爬坡試驗和中心組合試驗設計對培養基組分進行優化，得到優化培養基組分：預處理后糖蜜78.9 g/L、酵母粉2.2 g/L、初始pH 6.0。通過驗證實驗獲知與PDB培養基相比，優化后糖蜜培養基使CM2生物量提高了83.1%。

關鍵詞：葡萄有孢漢遜酵母；甘蔗糖蜜；Plackett-Burman試驗設計；培養基；生物量

酵母菌是一種單細胞真核微生物，是子囊菌、擔子菌等單細胞真菌的統稱[1]。酵母菌適宜生長在含糖量較高的偏酸性（pH 4.0～7.0）環境中，其本身含有大量的蛋白質和豐富的維生素，營養要求不高，能夠迅速生長[2]。在利用拮抗酵母菌發酵生產菌體及代謝產物時，培養基組分和配比對酵母菌的生長、發育、代謝以及發酵生產工藝有很大的影響，因此選擇合適的培養基成分及優化培養基顯得尤為重要。廢糖蜜是制糖業的一種主要副產物，價格低廉，含有豐富的適宜酵母菌生長的營養成分，總糖和蔗糖含量均很高，是發酵生產酵母菌的良好原料，現已作為一種生產原料被廣泛用于發酵領域[3]。利用甘蔗糖蜜作為碳源規模化培養酵母菌，具有重要意義。

葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）CM2是本實驗室從草莓果實上分離篩選獲得的拮抗酵母菌，前期的研究表明其對草莓[4]和葡萄[5-6]果實采后病害具有良好的抑制效果，具有良好的商業化前景。拮抗酵母菌商業化的發展受生產成本的影響，而生產成本很大程度上來源于發酵培養基。因此，優化發酵培養基是從實驗室到商業化生產的必要環節[7-8]。目前的研究表明，在優化微生物培養基的方法中，Plackett-Burman法和響應面法（response surface methodology，RSM）取得了良好的效果，其中Plackett-Burman法可以從多因子中篩選出主要影響因子，而RSM法通過對顯著因子的優化評價，可快速有效地確定最佳條件[9]。本實驗以CM2為研究對象，以甘蔗糖蜜為培養基碳源，研究糖蜜預處理方法及糖蜜培養基各組分對CM2生長的影響，最后利用Plackett-Burman和RSM法對培養基各組分進行優化，為發酵工藝提供數據參考。

1　材料與方法

1.1菌種與培養基

供試菌株葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）CM2為本課題組從草莓果實表面分離鑒定并培養保存[4]。

PDB培養基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。PDA培養基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂17 g/L，121 ℃滅菌20 min。糖蜜發酵培養基：將未處理或預處理的甘蔗糖蜜稀釋至適宜濃度，并按實驗要求加入相關成分，121 ℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

HVE-50自動滅菌鍋 日本Hirayama有限公司；SWCJ-ID型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；Nikon顯微鏡 日本尼康公司；SPX-150B-Z型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HZQ-F160型全溫振蕩培養箱 太倉市實驗設備廠；GL-21MC高速冷凍離心機 湘潭湘儀儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1 供試菌種的培養

從4 ℃保存菌種中挑取菌落，在PDA培養基上劃線，28 ℃條件下培養48 h，分離單菌落，活化兩代，將拮抗酵母菌從PDA斜面上挑取一環菌體轉接于含有100 mL PDB培養基的250 mL三角瓶中， 28 ℃、180 r/min條件下搖床培養18 h，做種子液。將培養好的種子液按2%接種量接入裝液量為100 mL的250 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min條件下培養，每3 h測定600 nm波長處的光密度（OD600 nm）值，以未接種的酵母液體培養基校正紫外-可見分光光度計的零點。以測定的OD600 nm為縱坐標，以培養時間為橫坐標，繪制酵母菌的生長曲線。由于發酵液濃度較大，需要適當稀釋后測定，以下實驗同。

1.3.2 糖蜜的預處理方法比較

對照：糖蜜用去離子水（1∶1，m/m，下同）稀釋后，離心，取上清液。

煮沸法：糖蜜用去離子水稀釋后，加熱煮沸20 min，離心，取上清液。

磷酸法：糖蜜用去離子水稀釋后，加熱煮沸，加濃磷酸至pH 2.0～3.0，靜置過夜離心，取上清液加入新配制的石灰乳回調至pH 6.0左右，65～70 ℃保溫30 min，加0.8%活性炭，離心，取上清液。

硫酸法：糖蜜用去離子水稀釋后，再加硫酸，調pH 2.0～3.0，95～100 ℃加熱 20 min，靜置過夜離心，取上清液加入新配制的石灰乳回調至pH 6.0左右，65～70 ℃保溫30 min，加0.8%活性炭，離心，取上清液。

亞鐵氰化鉀法：糖蜜用去離子水稀釋后，加0.1%亞鐵氰化鉀，調節酸堿度至pH 6.5，煮沸30 min后，同時加1%活性炭，離心，取上清液。

活性炭法：糖蜜用去離子水稀釋后，加1%顆粒炭吸附處理，離心，取上清液。

糖蜜中總糖及還原糖含量測定：總糖含量測定參照SB/T 10203—1994《果汁通用試驗方法》，將糖蜜樣品稀釋后用濃鹽酸處理，處理組直接用滴定法測總糖含量；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法測定[10]。

將預處理后的糖蜜稀釋至質量分數為5%，按2%接種量將種子液接入裝液量為100 mL的250 mL搖瓶中，28 ℃、180 r/min條件下每隔12 h測定酵母菌OD600 nm值。

選取糖蜜預處理效果最好的方法，測定拮抗酵母菌生長曲線。

1.3.3 培養基組分篩選單因素試驗

1.3.3.1 糖蜜質量濃度篩選

將硫酸法處理后的糖蜜用去離子水稀釋，調整糖蜜質量濃度分別為40、50、60、70、80、90 g/L，作為培養基。按2%接種量將酵母菌種子液接入250 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min條件下培養24 h后測定發酵液OD600 nm值，比較不同糖蜜質量濃度對拮抗酵母菌生長的影響。

1.3.3.2 初始pH值篩選

分別用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調整拮抗酵母菌液體培養基的pH值為4、5、6、7、8。按1.3.3.1節中的接種量和培養條件實驗，以考察初始pH值對拮抗酵母菌生長的影響。

1.3.3.3 氮源篩選

加入不同氮源（魚蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、硝酸鉀、尿素），在不同添加量（0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L）的條件下，按1.3.3.1節中的接種量和培養條件進行實驗，以考察不同氮源對酵母菌生長的影響。

1.3.3.4 無機鹽篩選

按1.3.3.1節中的接種量和培養條件，分別選KH2PO4和K2HPO4質量濃度均為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L；MgSO4質量濃度為0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 g/L；NaCl質量濃度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L。考察無機鹽對酵母菌生長的影響。

1.3.4 多種試驗設計法優化糖蜜培養基

1.3.4.1 Plackett-Burman試驗設計

采用Design-Expert進行Plackett-Burman試驗設計，每個因素取高低2 個水平，分別以“＋1”和“－1”表示，試驗因子高低水平的選取以單因素試驗結果為參考。接種量和培養條件同1.3.3.1節。

1.3.4.2 最陡爬坡試驗設計

由Plackett-Burman試驗設計篩選出對拮抗酵母菌生長的主要影響因子，根據回歸方程中各因子回歸系數大小及正負確定最陡爬坡的方向和步長，一般爬坡步長為Plackett-Burman試驗設計步長的1/3～1 倍[11]。接種量和培養條件同1.3.3.1節。

1.3.4.3 中心組合試驗設計

在最陡爬坡試驗結果的基礎上，采用具有旋轉性的中心組合試驗對顯著因素進行優化，每個因素取3個水平，以“－1”、“0”、“＋1”編碼。接種量和培養條件同1.3.3.1節。

1.3.5 拮抗酵母菌菌數的檢測

拮抗菌酵母的總菌數采用血球計數板進行觀察、統計。拮抗酵母菌活菌數用稀釋平板法記數，即將不同濃度梯度的菌液在PDA上鋪板，放置28 ℃條件下培養48 h后統計菌落個數[12]。

1.3.6 拮抗酵母菌生物量的測定

1.3.6.1 細胞干質量法

取發酵液10 mL，6 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗滌沉淀3 次，所得酵母菌在105 ℃烘箱烘干至恒質量，稱質量，換算成每毫升發酵液的菌體量，即為細胞生物量[13]。

1.3.6.2 比色法

在600 nm波長處測發酵液的光密度值，以未接種的酵母液體培養基作參照[14]。

1.3.7 驗證實驗

分別采用PDB培養基、無預處理糖蜜培養基、預處理糖蜜培養基及優化后的糖蜜培養基進行拮抗酵母菌搖瓶發酵實驗，比較拮抗酵母菌在不同培養基中的生長情況，驗證優化結果的可靠性。

1.4數據分析

采用Design-Expert和SAS軟件進行Plackett-Burman和中心組合試驗設計與數據統計，通過ANOVA方式，采用Duncan’s multiple range tests對不同處理之間的差異性在α＝0.05水平上進行分析。

2　結果與分析

2.1糖蜜預處理方法對拮抗酵母菌生長的影響

糖蜜成分復雜，含有重金屬離子、黑色素、膠體等不利于發酵的物質[15]，因此糖蜜不能直接用于發酵，需要先進行預處理，提高還原糖含量以利于酵母菌的生長。經測定，糖蜜處理前總糖含量為43.7%，還原糖含量為20.4%；硫酸法預處理后總糖含量為34.1%，還原糖含量為29.5%。由此可知，糖蜜經過預處理后還原糖含量明顯提高，有利于酵母菌的生長發酵。 由圖1可知，硫酸處理方法均優于其他處理方法。這是因為在糖蜜中加入硫酸，一方面可以分解膠體物質，另一方面也可將多糖轉化為酵母菌直接利用的單糖，促進其生長代謝；此外，硫酸法處理糖蜜在用加石灰乳回調pH值時可生成大量的石膏，過濾后得到澄清糖液[16]，便于酵母菌的生長。

圖1　糖蜜預處理方法對CM2生長的影響Fig.1 Effect of molasses pretreatment on biomass production of CM2

2.2拮抗酵母菌生長曲線

圖2　拮抗酵母菌生長曲線Fig.2 Growth curve of the antagonistic yeast CM2

由圖2可知，CM2在糖蜜培養基中延滯期很短，3～12 h為指數生長期，此階段細胞分裂速率快，酵母個數呈幾何級數生長狀態，12～21 h處于減速時期，酵母菌細胞數目雖然增加，但增加速率減緩，到21 h時CM2細胞數目達到最高值，21 h后生長處于穩定期，細胞數目基本保持不變。在后續實驗中，選擇細胞生物量比較穩定的時間作為培養時間，故選擇CM2培養時間為24 h。

2.3單因素試驗篩選培養基組分

2.3.1 糖蜜質量濃度篩選

由圖3可知，糖蜜質量濃度為60～70 g/L時，菌體生物量較大?？紤]生產原料節約利用原則，在后續實驗中選擇60～70 g/L作為CM2生長最適糖蜜質量濃度。

圖3　糖蜜質量濃度對拮抗酵母菌生長的影響Fig.3 Effect of molasses concentration on the growth of the antagonistic yeast

2.3.2 初始pH值篩選

圖4　初始pH值對拮抗酵母菌生長的影響Fig.4 Effect of initial pH on the growth of the antagonistic yeast

培養基pH值通過影響酵母細胞對培養基營養基質的利用效率進而影響酵母菌的生長代謝[17-18]。由圖4可知，CM2對較寬的pH值范圍都具有良好的適應性，CM2在pH值略偏酸性的培養基中生長狀況較好，且pH 5.0和pH 6.0基本無差異（P＞0.05）。

2.3.3 氮源篩選

表1　不同種類氮源對CM2生長的影響Table 1 Effect of different nitrogen sources on the growth of CM2OD600 nm

甘蔗糖蜜中所含氮源可部分被酵母菌利用，但其含氮量一般不足以滿足酵母菌生長的需要，通常都需要額外添加氮源以滿足菌體的生長[19-20]。由表1可知，有機氮源比無機氮源更有利于CM2酵母菌的生長。在相同添加量下，有機氮源中酵母粉的加入對酵母菌增殖作用最大，與其他幾種氮源相比差異顯著（P＜0.05）。無機氮源中只有硝酸鉀的加入使其生物量有小幅度的增加，而硫酸銨和尿素的加入反而對酵母菌的生長有所抑制；從添加量上分析，酵母粉添加量為1.0 g/L時，培養液的OD600 nm值最大，隨著添加量的增大，OD600 nm值反而下降。綜合考慮，后續優化中選酵母粉的添加量在0.5～1.0 g/L較適宜。

2.3.4 磷酸鹽篩選

圖 55 KKHH2PPOO4對拮抗酵母菌生長的影響Fig.5 Effect of KH2PO4on the growth of the antagonistic yeast

由圖5可知，KH2PO4的加入未使酵母菌生物量有顯著增加（P＞0.05），故糖蜜培養基中不需要額外加KH2PO4。

圖 66 KK2HHPPOO4對拮抗酵母菌生長的影響Fig.6 Effect of K2HHPPOO4on the growth of the antagonistic yeast

由圖6可知，糖蜜培養基中加入K2HPO4后，未使酵母菌生物量有明顯增加（P＞0.05），故糖蜜培養基不需要額外加入K2HPO4。

2.3.5 MgSO4添加量篩選

圖7　MgSO4對拮抗酵母菌生長的影響Fig.7 Effect of MgSO4on the growth of the antagonistic yeast

由圖7可知，鎂離子的添加沒有使酵母菌的生物量顯著增加（P＞0.05），這說明糖蜜培養基中有足夠的鎂元素供酵母菌營養和代謝需要。

2.3.6 NaCl添加量篩選

圖8　NaCl對拮抗酵母菌生長的影響Fig.8 Effect of NaCl on the growth of the antagonistic yeast

由圖8可知，在NaCl添加量小于3.0 g/L時，酵母菌生長基本沒有受到影響（P＞0.05），當NaCl添加量大于3.0 g/L時，酵母菌生長受到抑制，生物量明顯下降（P＜0.05），故以此糖蜜作為碳源的酵母培養基發酵過程不需要額外添加鈉離子。

2.4糖蜜培養基優化

2.4.1 Plackett-Burman試驗設計

表2　Plackett-Burman試驗設計及響應值Table 2 Plackett-Burman experimental design with Response values of CM2 biomass

表3　Plackett-Burman試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance for Response values of CM2 biomass from Plackett-Burman design

由表2、3可知，由Plackett-Burman試驗設計得出糖蜜質量濃度和酵母粉添加量對CM2生物量的生成有顯著影響（P＜0.05），且均與CM2的生物量生成呈正相關，即隨著這兩個因素水平的增加，CM2生物量逐漸增加；其他各因素對結果影響并不顯著（P＞0.05）。通過回歸分析，得到CM2的多元回歸方程如下：

式中：Y為CM2生物量的預測值。該模型相關系數R2=0.986 6，R2Adj=0.950 8，說明試驗中98.66%的變異可以由方程解釋，模型擬合良好，具有很高的可靠性。

2.4.2 最陡爬坡試驗設計

表4　最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Steepest ascent experimental design and results

由表4可知，CM2在步驟4和步驟5的時候有最大的生物生成量，故選擇這兩個步驟中糖蜜質量濃度和酵母粉添加量的平均值作為中心組合試驗設計的中心點。

2.4.3 中心組合試驗設計

表5　中心組合試驗設計及結果Table 5 Central composite design (CCD) and results

以CM2酵母生物生成量為響應值，依據表5設計中的試驗結果，利用Design-Expert對結果進行二次回歸分析，得到回歸方程為：

由表6可知，模型達到極顯著水平（P＜0.01）。同時，一次項對結果影響顯著（P＜0.05），平方項對結果影響極顯著（P＜0.01），其中酵母粉添加量比糖蜜質量濃度對CM2的生物量影響更大。該模型的R2=0.968 9，R2=0.946 6，表明模型擬合度良好。

Adj

表6　中心組合試驗方差分析Table 6 Analysis of variance for the regression model

圖9　響應面立體分析圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of yeast power and molasses concentration on the production of CM2 biomass

由圖9可知，回歸方程存在穩定點，即極大值點。通過嶺嵴分析得到極大值所對應各因素（X1，X2）的編碼值分別為（0.15，0.19），轉化為實際條件即為糖蜜質量濃度（X1）78.9 g/L，酵母粉添加量（X2）2.2 g/L，在此條件下，CM2發酵液OD600 nm的預測值為0.90。

2.5驗證實驗

圖10　不同培養基中拮抗酵母菌CM2的生物量Fig.10 Biomass production of the antagonistic yeast in different culture media

由圖10可知，優化后的糖蜜培養基大大提高了拮抗酵母菌的生物量。優化后糖蜜培養基CM2的生物量為（11.9±0.9） g/L，PDB培養基的生物量為（6.5±0.5） g/L，與PDB培養基比，優化后的糖蜜培養基使CM2生物量提高了83.1%。說明試驗設計可靠，優化糖蜜培養基可作為下一步試驗的基礎培養基。

3　結論與討論

糖蜜作為碳源已成功應用于拮抗酵母Pichia anomala[21]、P. agglomerans[22]及Candida sake[23]的發酵生產過程。但目前還沒有將糖蜜應用于拮抗酵母H. uvarum發酵生產的相關報道。在本實驗中，硫酸預處理后的糖蜜作為碳源使酵母菌的生物量有了較大幅度的提升，這一結果與對Rhodosporidium paludigenum[13]及Blakeslea tripora[24]培養基優化的結果相類似。甘蔗糖蜜含氮量比較低（一般在0.4%～1.5%左右），而酵母粉中含有氨基酸、水溶性維生素、多肽及生長因子等多種營養成分，是許多微生物生長的良好氮源[25]，在發酵工藝中發揮著重要的作用。本實驗中，酵母粉對CM2具有良好的促進作用，并且通過響應面優化得出酵母粉的使用量均低于3 g/L，較低的酵母粉使用量也表明了其工業化生產的經濟可行性。初始pH值是影響酵母菌生長的另一重要因素，本實驗中單因素試驗結果表明CM2對較寬pH值范圍均具有良好的適應性，且在pH 6.0時生長的最好。通過響應面優化后，初始pH值的大小對CM2的生物量并未顯示出顯著影響，這是因為甘蔗糖蜜在用硫酸法預處理時最終的pH值是調至6.0左右的，本實驗中所用的甘蔗糖蜜價格低廉，優化后的糖蜜培養基相對實驗室常用的PDB培養基成本低，甘蔗糖蜜的使用不僅提高了酵母菌的生產量，同時也降低了生產成本，便于工業規?；a。

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Optimization of Molasses Medium Composition for Hanseniaspora uvarum CM2 as a Biocontrol Yeast

CAI Zikang, WANG Xiaoxia, QIN Xiaojie,YANG Rong, SI Linyuan, XIAO Hongmei*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract:The composition of a sugarcane molasses-based medium used to culture Hanseniaspora uvarum CM2 was optimized for enhanced biomass production. The molasses was pretreated by boiling or adding phosphoric acid, sulfuric acid, potassium ferrocyanide and activated carbon, respectively. Comparing their impacts on the growth of the antagonistic yeast CM2, sulfuric acid addition was considered the method of choice. Molasses concentration, the type and concentration of nitrogen source, initial pH, phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride were studied for their influence on the biomass production of CM2 by single factor design. Plackett-Burman design and response surface methodology were used to optimize the medium components as pretreated molasses 78.9 g/L, yeast powder 2.2 g/L and initial pH 6.0. The optimal medium could result in an 83.1% enhancement in the biomass production of CM2.

Key words:Hanseniaspora uvarum; sugarcane molasses; Plackett-Burman experimental design; medium; biomass

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507022

中圖分類號：TS201.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0117-07

*通信作者：肖紅梅（1970—），女，副教授，博士，研究方向為農產品貯藏加工。E-mail：xhm@njau.edu.cn

作者簡介：蔡子康（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：2013108039@njau.edu.cn

基金項目：江蘇省科技計劃項目（BE2010385）

收稿日期：2014-07-08