固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白生產ACE抑制肽的條件優化

周慧敏，劉 琛，郭宇星,*，潘道東,，曾小群，孫楊贏

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211）

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固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白生產ACE抑制肽的條件優化

周慧敏1，劉 琛1，郭宇星1,*，潘道東1,2，曾小群2，孫楊贏2

（1.南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211）

摘 要：以乳清濃縮蛋白WPC-80為原料，研究固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解WPC-80生產血管緊張素轉化酶（angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE）抑制肽的工藝條件。通過單因素試驗和響應面方法研究了酶解溫度、酶解pH值、底物與酶質量比（[S]/[E]）、酶解時間對固定化瑞士乳桿菌蛋白酶制備ACE抑制肽的影響，確定了酶解乳清蛋白制備ACE抑制肽的最佳工藝條件為：溫度37 ℃、pH 7.5、[S]/[E]＝15%、酶解時間8 h。在此條件下，酶解產物的水解度為（6.05±0.36）%，ACE抑制率為（59.54±0.61）%。

關鍵詞：ACE抑制肽；固定化瑞士乳桿菌蛋白酶；乳清蛋白；響應面法

血管緊張素轉化酶（angiotensinⅠ-converting nzyme，ACE）作為一種外肽酶，它可以使血管緊張素Ⅰ轉變為有血管收縮調節活性的血管緊張素Ⅱ，并水解緩激肽（有血管舒張作用），使其失去活性，通過這兩個作用，ACE可使得人體血壓升高[1-3]。ACE抑制肽則可以抑制ACE的活性，達到抗血壓升高的作用。ACE抑制肽的制備方法主要包括酶解法、化學合成法、自溶產物提取法及DNA重組法。據調查，目前大多數高血壓患者使用合成ACE抑制劑如卡托普斯等藥物來治療高血壓，但這類合成藥物會引起咳嗽、喪失味覺及血管神經性水腫等副作用[4-6]。而酶解制備ACE抑制肽的方法專一性較強，反應條件溫和，易于控制以及副產品少，不會產生毒性方面的問題。目前采用的酶包括胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶等[7-8]。據報道，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）蛋白酶活性較強，能特異性水解乳蛋白產生ACE抑制肽[2]。但在研究中發現，瑞士乳桿菌蛋白酶獲得較困難且不能重復利用，不易實現ACE抑制肽的規模化制備。因此，本實驗用固定化瑞士乳桿菌蛋白酶水解乳蛋白制備ACE抑制肽，固定化酶可以在較長時間內反復使用，減少生產成本。

本研究通過單因素酶解條件的研究和響應面分析，優化固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白生產ACE抑制肽的工藝條件，旨在為ACE抑制肽的規模生產及制備提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）JCM 1004南京師范大學國家農產品加工技術研發乳制品專業分析中心保存。

MRS液體培養基、考馬斯亮藍G-250 國藥集團化學試劑有限公司；WPC-80乳清濃縮蛋白粉 北京潤發商貿有限公司；海藻酸鈉、氯化鈣、戊二醇 南京金慶祥貿易有限公司；血管緊張素轉化酶（angiotensinⅠ-converting enzyme，ACE）、Hippuryl-L-histidyl-L-leucine （HHL）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES） 美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

JY92-II超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；LRH-250A生化培養箱 廣東省醫療儀器廠；CJ-2S超凈工作臺 上海上凈凈化設備有限公司；PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠；754紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；CL-22M高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公司；LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.3方法

1.3.1 瑞士乳桿菌蛋白酶的制備

瑞士乳桿菌活化[9]：取瑞士乳桿菌JCM 1004凍干粉接種于MRS液體培養基，連續活化3 代，制成種子液。按體積分數3%接種量，37 ℃擴大培養至生長對數期取出，收集菌體，用pH 7.1（50 mmol/L）的Tris-HCl緩沖液洗滌菌體后備用。洗滌后菌體在功率300 W，破碎時間為3 s，間隔時間為5 s的超聲波破碎條件下破碎200 次提取瑞士乳桿菌蛋白酶[10-11]。

1.3.2 瑞士乳桿菌蛋白酶含量的測定

采用考馬斯亮藍法[12]測定。

1.3.3 海藻酸鈉固定瑞士乳桿菌蛋白酶

參考文獻按[13-15]方法進行。在30 mL瑞士乳桿菌蛋白酶液中加入0.6 g海藻酸鈉，37 ℃水浴攪拌混勻。用10 mL注射器吸取混合液，以15 cm左右高度滴入0.1 mol/L的氯化鈣溶液中，立即成球。4 ℃條件下靜置4 h，用蒸餾水洗滌小球后加入0.4 g/100 mL的戊二醛溶液交聯6 h，洗滌瀝干，得到固定化蛋白酶。實驗在無菌操作條件下進行。固定化瑞士乳桿菌蛋白酶通過蒸餾水洗滌瀝干可以重復利用。 按[16]方法進行。稱取固定化瑞士乳桿菌蛋白酶小球1 g，加入濃度為16.4 mmol/L MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA（MS-Arg）0.05 mL，Tris-HCl（pH 7.8）緩沖液2.95 mL。混合均勻后，在37 ℃恒溫水浴鍋反應2 h，以蒸餾水作為對照，取上清液在410 nm波長處測吸光度。固定化瑞士乳桿菌蛋白酶活力定義為37 ℃時，每小時吸光度上升0.01為一個酶活力單位（U）。

1.3.4 固定化酶活力的測定

1.3.5 乳清蛋白的酶解及水解度計算

乳清蛋白的酶解按參考文獻[17]方法進行。WPC-80乳清濃縮蛋白粉用蒸餾水配制成6 g/100 mL質量濃度，65 ℃恒溫預孵15 min，使其充分溶解，用NaOH和HCl溶液調至實驗預設的pH值，降至實驗預設的溫度，然后加入固定化瑞士乳桿菌蛋白酶進行酶解。每隔一定時間加入NaOH（0.1 mol/L）用以維持酶解pH值，記錄滴加的NaOH量，可計算水解度。酶解結束后進行滅酶（90 ℃，20 min），離心（4 500 r/min，20 min）取上清液測定多肽的ACE抑制活性。

乳清蛋白水解度的測定采用pH-Stat法[17]。

式中：V為消耗的NaOH體積/mL；c為NaOH的濃度/（mol/L）；α為α-氨基的平均解離度，在pH值為7.0和50 ℃的實驗條件下，對乳清濃縮蛋白而言，α為0.44；m為蛋白質的質量/g；htot為每克原料蛋白質中肽鍵的毫摩爾數，對于乳清濃縮蛋白而言，該值為8.8 mmol/g。

1.3.6 酶解產物ACE抑制活性測定

采用Cushman等[18]的方法適當修改。取200 μL的5 mmol/L HHL溶液（6.7 mmol/L HHL，50 mmol/L HEPES，300 mmol/L NaCl，定容至50 mL，調pH值至 8.3）和 100 μL待測樣品，37 ℃條件下保溫3 min，然后加入20 μL ACE 溶液（0.1 U/mL），混勻后37 ℃保溫60 min，加入250 μL HCl（1.0 mol/L）終止反應，然后加入1.7 mL醋酸乙酯，15 s旋渦混勻，離心（4 000 r/min，15 min）后取1.0 mL的醋酸乙酯層，于烘箱中30 min蒸干，再將其溶于1 mL去離子水，用紫外分光光度計測定吸光度（A228 nm）。

式中：A為加待測樣品，ACE和HHL反應的吸光度；A0為不加待測樣品，ACE和HHL反應的吸光度。

1.3.7 試驗設計及數據處理

單因素酶解條件選擇酶解溫度、酶解pH值、底物與酶質量比（[S]/[E]）、酶解時間4 個因素，在單因素試驗基礎上確定水平，按Box-Behnken原理進行響應面分析，采用Minitab16.0進行數據處理以評價模型的統計學意義。

2　結果與分析

2.1固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白單因素條件研究

2.1.1 酶解溫度的影響

圖1　酶解溫度對水解度和酶解產物ACE抑制活性的影響Fig.1 Effect of temperature on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of hydrolysate

將酶解溫度設置為25、31、37、43、49 ℃，其他酶解條件設置為pH 7.5，[S]/[E]＝15%，底物質量濃度6 g/100 mL，酶解時間8 h，考察酶解溫度對固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白水解度和酶解產物ACE抑制活性的影響，結果見圖1。固定化瑞士乳桿菌蛋白酶在酶解溫度為35～40℃時酶反應效果較好。在37 ℃時乳清蛋白水解度和酶解產物的ACE抑制率都最高，37 ℃為固定化瑞士乳桿菌蛋白酶最適反應溫度；37 ℃之后，溫度逐漸超過酶的最適反應溫度，酶的活性開始減弱。在本實驗中，固定的瑞士乳桿菌蛋白酶的酶活力為（3.80±0.16） U/mg，并且該固定化蛋白酶可以重復使用。由于海藻酸鈉載體的保護，固定的酶不像游離酶那樣驟然失活，而是緩慢減弱活性[19]。

2.1.2 酶解pH值的影響

圖2　酶解pH值對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.2 Effect of pH on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity

酶解pH值設定5 個條件，分別為pH 5.5、6.5、7.5、8.5和9.5，其他酶解條件設置為溫度37 ℃、[S]/[E]＝15%、底物質量濃度6 g/100 mL、酶解時間8 h，考察酶解pH值對固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白的水解度和酶解產物ACE抑制活性的影響，結果見圖2。在pH值為7.5時，固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白的水解度和酶解產物的ACE抑制率最高，當pH值進一步升高，水解度和酶解產物的ACE抑制率明顯下降。這說明固定化瑞士乳桿菌蛋白酶的最適酶解pH值為7.5。酶的最適酶解pH值會受各種因素的影響，pH值對酶活力產生的影響主要原因是pH值會影響酶分子和底物的帶電狀態，從而進一步影響了酶與底物的結合[20-21]。

2.1.3 [S]/[E]的影響

圖 33 [[S]]//[[E]對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.3 Effect of [S]/[E]ratio on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity

[S]/[E]設置為5%、10%、15%、20%、25% 5 個條件，其他條件設置為溫度37 ℃、酶解pH 7.5、底物質量濃度6 g/100 mL，酶解時間8 h，考察[S]/[E]對固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白水解度和酶解產物ACE抑制活性的影響，結果見圖3。[S]/[E]達到15%時，水解度最高，酶解產物ACE抑制率最大，隨著[S]/[E]進一步增加，水解度和ACE抑制率都有不同程度的下降，這是因為當底物與酶質量比較高時，底物過剩使得酶與底物結合的機率降低，產物對ACE抑制率下降[22-23]。

2.1.4 酶解時間的影響

固定酶解溫度37 ℃、酶解pH 7.5、[S]/[E]為15%，底物質量濃度為6 g/100 mL，觀察酶解時間0～12 h的水解度和酶解產物ACE抑制活性，考察酶解時間對固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白水解度和酶解產物ACE抑制活性的影響，結果見圖4。在前8 h內，隨著酶解時間的延長，水解度和ACE抑制率都呈上升趨勢，這是因為在酶解開始時，底物乳清蛋白較多，但隨著酶解過程的進行，乳清蛋白越來越少，當8 h時乳清蛋白的酶解幾乎完成，此后水解度增加趨勢減緩，而ACE抑制率卻有明顯的下降，這一結果與Mullally等[1]報道的結果相類似，長時間的酶解會使ACE抑制肽酶解成氨基酸，由此減弱了產物的ACE抑制活性。因此綜合考慮，8 h為合適的酶解時間。

圖4　酶解時間對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity

單因素酶解條件的研究發現，酶解溫度、酶解pH值、[S]/[E]、酶解時間都影響固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白的酶解程度。其中，酶解時間對水解度和酶解產物的ACE抑制活性的產生很有規律，隨著酶解的進行，水解度和酶解產物的ACE抑制活性逐漸升高而后維持在穩定狀態。然而，酶解溫度、酶解pH值、[S]/[E]對水解度和酶解產物的ACE抑制活性的影響有不確定性，因此在后續實驗中選用酶解溫度、酶解pH值、[S]/[E]3 個因素，進行響應面分析來優化酶解條件。

2.2固定化瑞士瑞桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白制備ACE抑制肽的響應面分析

以酶解溫度（A）、酶解pH值（B）及[S]/[E]（C）為變量，水解度和ACE抑制率為響應值。試驗結果見表1、回歸系數見表2、方差分析見表3。

采用Minitab 16.0對表1結果進行非線性回歸的二次多項式擬合，得到響應變量乳清蛋白酶解產物ACE抑制率（Y）的編碼二次多項式擬合方程的預測模型方程：

Y=59.430 0－0.893 7A－0.606 2B＋0.365 0C－0.070 0AB－0.017 5AC＋0.032 5BC－15.225 0A2－10.135 0B2－6.157 5C2（3）

表1　響應面試驗設計方案及結果Table 1 experimental design and results of response surface methodology

表3　酶解產物ACE抑制活性結果的方差分析TTaa bbllee 33 ANOVA for AACE inhibitory activity of whey protein hydrolysate

表2為模型方程的回歸系數表，其中因素A、B、C 對ACE抑制活性的影響都是極顯著的。方程的二次項影響也是極顯著的（P＜0.01），交互項影響一般（P＞0.05），說明響應值的變化較復雜。從表2的回歸系數表中可以看出，水解度的調整相關系數R2=99.90%，表3中失擬項P=0.067＞0.05，說明二次多

Adj項式回歸模型正確，回歸效果較好。

圖5　各變量交互作用對ACE抑制活性的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of three variables on ACE inhibitory activity

圖5為各相應變量的響應面曲面和等高線圖。各變量的交互作用對ACE抑制活性的影響較復雜。各個具體的試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是二次關系[24]。由圖5a可知，當溫度一定時，在pH 7.0～8.0和[S]/[E]為15%左右時，ACE的抑制率較高，由圖5b可知，當pH值一定時，ACE抑制率較好的值落在溫度37 ℃左右和[S]/[E]在15%左右的范圍內；由圖5c可知，當底物與酶的質量比一定時，ACE抑制率較好的值落在pH 7.0～8.0和溫度37 ℃的范圍內，其中任何兩個因素的改變都會引起抑制率的降低。采用Minitab 16.0軟件進行分析，可以求得最佳的酶解條件為：溫度37 ℃、pH 7.5、[S]/[E]＝15%，在此條件下，可得預測值ACE抑制率為59.47%。在此條件下行驗證實驗，最后得到酶解產物水解度為（6.05±0.36）%，ACE抑制率為（59.54±0.61）%，說明采用響應面法優化得到的酶解工藝條件參數可靠，本實驗建立的模型在實踐中進行預測是可行的。

3　結 論

通過單因素分析和響應面試驗設計，確定了固定化瑞士乳桿菌蛋白酶酶解乳清蛋白的最佳酶解條件為：酶解溫度37 ℃、pH 7.5，[S]/[E]＝15%，乳清蛋白底物質量濃度6 g/100 mL，酶解時間8 h。在此條件下，理論酶解產物ACE抑制率達到59.47%，經實驗驗證，酶解產物的水解度為（6.05±0.36）%，ACE抑制率為（59.54±0.61）%，酶解產物經冷凍干燥后為乳白色粉末，有奶香，溶解性良好。本實驗對ACE抑制肽的制備做了相對基礎的研究，為其大規模投入生產提供理論指導，后續將開展固定化酶解-超濾耦聯技術的研究以實現ACE抑制肽的連續制備。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for Production of ACE Inhibitory Peptides from Whey Protein Using Immobilized Proteinase of Lactobacillus helveticus

ZHOU Huimin1, LIU Chen1, GUO Yuxing1,*, PAN Daodong1,2, ZENG Xiaoqun2, SUN Yangying2
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China; 2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Abstract:Angiotensin Ⅰ-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from WPC (whey protein concentrate)-80 were prepared by the immobilized proteinase produced by Lactobacillus helveticus. The effects of enzymatic hydrolysis conditions including temperature, pH, substrate to enzyme ([S]/[E]) ratio and hydrolysis time on degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity were investigated using single factor method and response surface methodology. The optimum temperature, pH, [S]/[E]ratio and hydrolysis time were found to be 37 ℃, 7.5, 15% and 8 h, respectively. Under these conditions, the degree of hydrolysis was (6.05 ± 0.36)%, and the ACE inhibitory activity of the hydrolysate was (59.54 ± 0.61)%.

Key words:ACE inhibitory peptides; immobilized proteinase of Lactobacillus helveticus; whey prote in; response surface methodology

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507012

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0061-05

*通信作者：郭宇星（1981—），女，講師，博士，研究方向為乳品科學。E-mail：guoyuxing1981@163.com

作者簡介：周慧敏（1991—），女，碩士研究生，研究方向為乳品科學。E-mail：873093498@qq.com

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（31101314）；江蘇省自然科學基金面上項目（BK2011787）；江蘇省高校自然科學研究項目（13KJB550013）；浙江省自然科學基金項目（LQ12C20003）；寧波市科技局自然科學基金項目（2012A610145）

收稿日期：2014-05-25