粗球孢子菌病原學鑒定及形態學參數分析

國九英，秦 錚，樊 華，安春麗

粗球孢子菌病原學鑒定及形態學參數分析

國九英1，秦 錚2，樊 華1，安春麗1

目的 建立粗球孢子菌的形態學參數并對相關數據進行分析，為粗球孢子菌病原學鑒定提供數字化資料。方法 取粗球孢子菌肺感染患者痰液進行巴氏染色，應用顯微鏡攝像系統采集粗球孢子菌圖像，通過計算機數字圖像分析系統測量粗球孢子菌的長徑，短徑，周長，面積，計算其圓球度等一系列形態學參數。應用SPSS數據處理軟件對采集到的數據進行統計學分析。結果 測量粗球孢子菌297個，長徑均值為70.91 μm，最大值為110 μm，最小值為33 μm；短徑均值為54.46 μm，最大值為92 μm，最小值為27 μm；周長最大值為382 μm，最小值 116 μm，平均值為227.60 μm；面積最大值85.93 mm2，最小值8.49 mm2，平均值為30.75 mm2。結論 利用計算機數字圖像分析系統和SPSS數據處理軟件獲得粗球孢子菌長徑、短徑、周長、面積、圓球度等的累加、均值、標準差、最大值、最小值及95%可信區間等一系列形態學參數。粗球孢子菌形態學參數和數據的建立為量化及鑒別該菌提供了可靠的資料。

粗球孢子菌；形態學參數；數字圖像分析

粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)是一種深部感染真菌，為雙相菌屬。在自然界中通常以菌絲型存在，分隔成段，形成有傳染性的關節孢子，稱為關節菌絲型；而在人及動物組織內則形成球形厚壁，產生許多內生孢子，稱為孢子型；有時二者可互相轉化[1]。粗球孢子菌主要存在于土壤、空氣、水、動物皮毛和糞便中，通過呼吸道、消化道、粘膜及傷口侵入機體。這種真菌所致的球孢子菌病(Coccidioidomycosis)主要流行于美國西南部的半干旱地區，在我國較為少見[2]。多數原發性球孢子菌感染局限于肺臟，常表現為輕度的自限性呼吸道感染。少數病例形成播散性致死性全身感染，預后不佳[3]。肺部感染的粗球孢子菌形態及大小已有一些描述，但各家報道的大小不盡一致。數字圖像處理技術(digital image processing) 可以對顯微鏡下微小物體進行客觀、精確地測定，可靈活、大量地獲得形態學相關信息，且因具有快速、簡捷易操作等優點而倍受關注[4]。近年來,數字圖像處理技術已被用于寄生蟲學領域的研究中[5]。本實驗采用數字圖像分析技術分析引起肺感染的粗球孢子菌的形態學特征,旨在為粗球孢子菌病原學的研究提供更加準確的形態學參數。

1 材料和方法

1.1 粗球孢子菌來源及標本處理 收集一位確診為肺球孢子菌病患者的痰液。用滅菌的接種環沾取患者痰液與少許生理鹽水混勻，涂于載玻片上，形成直徑約為1 cm左右的薄膜，自然干燥后，95%乙醇固定，采用巴氏染色(PapanicoiauStain)方法對標本進行染色，封片后顯微鏡下觀察。

1.2 圖像采集及形態學參數測量 顯微鏡下觀察粗球孢子菌包囊，選取背景清晰，包囊數量多的視野，經攝像系統采集粗球孢子菌包囊的圖像。使用MetaMorph/DP10/BX41數字圖像處理系統測量采集到的包囊的長徑、短徑、周長、面積等參數。計算出包囊的體積、等效直徑及圓球度[6]。

1.3 統計分析 利用SPSS 19.0數據處理軟件對相關數據進行統計分析。

2 結 果

痰液中的粗球孢子菌經巴氏染色后，孢子體呈褐色、圓形或近圓形，具有較厚的孢子壁，含內生孢子(圖1)。從不同視野中共采集了297個形態完整的孢子體，測量各項指標的數據，進行統計分析，結果見表1。孢子體長徑數據的分布情況如圖2和表

1所示。孢子體長徑最大值為110 μm，最小值為33 μm，平均值為70.91μm。其中55.89%(166/297)的孢子體長徑主要分布于60～84 μm之間。孢子體短徑數據的分布情況如圖3所示。其中53.20%(158/297)的孢子體的短徑在48～68 μm之間，短徑的最大值為92 μm，最小值為27 μm，平均值為54.46μm；孢子體周長數據的分布情況見圖4。其中61.28%(182/297)孢子體的周長在197～278 μm之間，其最大值為382 μm，最小值 116 μm，平均值為227.60 μm；孢子囊的面積數據分布情況如圖5所示。64.98%的孢子體面積在17～40 μm之間(193/297)，最大值85.93 mm2，最小值8.49 mm2，平均值為30.75 mm2。孢子體的圓球度均值為0.67，最大值為1，最小值為0.30。

圖1 痰涂片標本中的粗球孢子菌孢子體(巴氏染色，200×)

Fig.1 Spherules ofCoccidioidesimmitisin sputum (Papanicoiaustain, 200×)

表1 297個粗球孢子菌孢子體的相關測量數據

圖2 粗球孢子菌孢子體長徑的數據分布

Fig.2 Distribution ofCoccidioidesimmitiswith the long diameter in spherules

圖3 粗球孢子菌孢子體短徑的數據分布

Fig.3 Distribution of the short diameter in spherules ofCoccidioidesimmitis

圖4 粗球孢子菌孢子體周長的數據分布

Fig.4 Distribution of the perimeter inCoccidioidesimmitisspherules

圖5 粗球孢子菌孢子體面積的數據分布

Fig.5 Distribution of the area inCoccidioidesimmitisspherules

3 討 論

本實驗采用計算機數據圖像分析技術對球孢子

菌病患者痰液中的粗球孢子菌進行形態學參數的測定及分析。測量了297個孢子體，其結果這與國內外文獻中記載球孢子菌孢子體直徑范圍10～80 μm基本一致[8-9]。進一步說明數字圖像處理技術在測量粗球孢子菌形態學參數的客觀性。通過本次實驗測量計算出粗球孢子菌的圓球度均值為0.67，最大值為1，最小值為0.13。圓球度反應的是非球形顆粒的形狀與球形的差異，圓球度的值愈小，說明顆粒的形狀與圓球的差異愈大。

我國為粗球孢子菌病的非流行區，臨床上對該真菌缺乏了解，且不同的染色方法和攜菌標本的不同更加大了認識該菌的難度，容易造成誤診，延誤病情。數字圖像處理技術可以對顯微鏡下微小物體進行客觀、精確地測定，可靈活、大量地獲得形態學相關信息，且因具有快速、簡捷易操作等優點。國內外尚未見用此技術檢測粗孢子菌的報道。本研究利用數字圖像處理技術測量了粗球孢子菌。獲得了其長徑、短徑面積、周長、等效直徑、圓球度等一系列的精確數據，不僅補充了該菌的形態學資料，還為臨床檢驗和診斷粗球孢子菌病提供了有意義的參考依據。

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Etiological identification and morphological parameters ofCoccidioidesimmitis

GUO Jiu-ying1,QIN Zheng2,FAN Hua1,AN Chun-li1

(1.DepartmentofPathogenBiology,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;2.InstituteofRespiratoryDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

In this study, we aimed to establish the morphological parameters ofCoccidioidesimmitis, providing digital data for the etiological identification. Taking sputum of theCoccidioidesimmitispulmonary infection patients for Papanicolaou staining, theCoccidioidesimmitisimages were obtained by computer photographic system, and the length, width, perimeter, and area ofCoccidioidesimmitiswere determined by computer digital image, and then the analysis of these dada were conducted by SPSS. It was found that when 297Coccidioidesimmitiswere measured, the average length, width, perimeter, and area were 70.91 μm, 54.46 μm, 227.60 μm, and 30.75 mm2, respectively. Meanwhile, the length of the maximum values was 110 μm, the width was 92 μm; the largest and least perimeters were 382 μm and 116 μm; and the areas were 85.93 mm2and 8.49 mm2. It seems that the set of morphological parameters provide reliable information for identifyingCoccidioidesimmitis.

Coccidioidesimmitis; morphological parameters; digital image analysis

An Chun-li, Email:cmucl@126.com

國家自然科學基金(No.81370189)

安春麗，Email：cmucl@126.com

1.中國醫科大學基礎醫學院病原生物教研室，沈陽 110122； 2.中國醫科大學附屬一院呼吸疾病研究所，沈陽 110001

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.004

R382

A

1002-2694(2015)02-0113-03

2014-08-25；

2014-11-26

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 81370189)