滅釘螺微生物的篩選及功效研究

崔國艷，汪世平，程紅兵，何 鑫，閭丘思嘉，黃成銘

滅釘螺微生物的篩選及功效研究

崔國艷1,2，汪世平1，程紅兵2，何 鑫1，閭丘思嘉1，黃成銘1

目的 消滅釘螺是防治血吸蟲病重要工作，篩選出一種高效、低毒、持久及價廉的殺螺細菌是有意義的探索。方法 本文從釘螺孳生的土壤中篩選出具有殺螺作用的強毒菌株，分別制備成細菌發酵液、發酵上清液和菌體懸液進行浸泡殺螺比較，取得了初步結果。結果 經初篩，分離出4株(B8、B27、B36、B59)對釘螺具有毒性作用的細菌；滅螺實驗結果表明，4株細菌的發酵液、發酵上清液和菌體懸液均顯示出不同的毒殺作用，綜合比較發現，B59菌株的滅螺效果最好，其次是B27、B36菌株，B8菌株最弱。在細菌發酵上清液各菌株間滅螺效果差異有統計學意義(χ2=21.286，P=0.002)；各菌株發酵液的滅螺效果差異也有統計學意義(χ2=17.298，P=0.008)；但各菌株菌體懸液之間的滅螺效果未顯示統計學差異(χ2=7.579，P=0.271)。結論 細菌的代謝產物，尤以B59菌株的發酵上清液有較好的滅螺功效。

血吸蟲病；釘螺；微生物；滅螺效果；死亡率

血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康和社會經濟發展的人獸共患寄生蟲病，主要流行于發展中國家，每年約207萬人感染日本血吸蟲，將近800萬人受感染的威脅，且感染人數在發展中國家仍呈上升態勢[1-2]。我國是日本血吸蟲病流行最為嚴重的國家，約1億人受血吸蟲病的威脅[3]。釘螺是日本血吸蟲的唯一中間宿主，是造成日本血吸蟲病流行的重要根源。目前滅螺的方法主要有3類，物理滅螺工程浩大，費事費力，滅螺效果慢，且適用范圍相對較少；化學藥物滅螺存在選擇性弱、持久性差、價格高、易污染環境且需反復滅螺等問題[4-5]；生物滅螺環保、低廉，通過改變釘螺的孳生環境或者使用天敵，打破原有的種群平衡，環境保護意義重大[6]。微生物滅螺對非靶生物無毒性、高效、穩定，對釘螺有定向特異性。相比其它生物而言，微生物及其代謝產物具有更多的生物多樣性、生長周期短、可誘導產物產生等特點[7]，是生物滅螺中較有前景的研究方向。近年來國內外學者從疫區釘螺孳生地篩選出一批滅螺微生物，但由于對其殺螺活性成份、如何致毒等問題尚不明確，因此實際應用效果并不理想[8-12]。所以在環保問題日益嚴峻的今天，尋找一種對人畜、農作物及水生物無害的、對釘螺殺傷力強的微生物迫在眉睫。本研究擬從釘螺孳生地的土壤中篩選出一批對釘螺具有毒殺作用的微生物，為尋找理想的滅螺微生物及其代謝產物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 從湖南省汨羅市血吸蟲病防治研究現場實驗基地釘螺池中采集土壤樣本15份，毒性試驗釘螺亦采自實驗基地同一生態螺池中的野外釘螺,在實驗室適應性飼養3 d后，挑選7-8旋活力強的成螺。

1.2 樣本處理 每份土壤樣本取細土10 g于三角瓶中，加入90 mL無菌蒸餾水中，搖床振蕩30 min混勻，制成懸液備用。

1.3 分離培養 取制備的土壤懸液各1 mL，采用梯度稀釋法稀釋至10-5、10-6，取 0.2 mL涂布于LB平板上(2個平行)，30 ℃培養3～4 d觀察培養細菌菌落形態。分離的菌株經3次純化后，移至LB斜面培養基上，4 ℃保存備用。

1.4 初篩 將上述得到的純菌株轉至LB液體培養液中振蕩培養48 h后，分別配制成1%菌液浸泡釘螺24～48 h，篩選出對釘螺致死率>50%的菌株。20%甘油保種，-20 ℃備用。

1.5 細菌成分的制備 將初篩得到的各純菌株轉接至LB培養液中，30 ℃振蕩培養72 h，用血球計數板計數，并調整各初篩菌株的濃度為2×108個/mL；離心，收集各菌沉淀及上清液，將上清液用微孔濾膜過濾除菌后，-20 ℃保存備用；菌體沉淀用無菌水懸浮，調整其密度使其與各菌液濃度一致，4 ℃保存備用。

1.6 釘螺毒性試驗

1.6.1 滅螺考核方法 將細菌發酵液(bacteria fermented liquor,BFL)、菌體懸浮液(bacteria suspension,BS)及發酵上清液(fermented supernatant,FS)分別用去氯水稀釋20倍后配制成5%(v/v)的溶液。室溫下，挑選野外采集的螺齡相仿、活力強的成螺，每容器投放3袋釘螺(尼龍網袋)，20只/袋，共60只釘螺，分別置于各溶液中浸泡24 h、48 h和72 h后，取出釘螺，用水逸法和敲擊法測定釘螺死活，同時設去氯水和培養液為對照組，記錄各組釘螺的死亡數和死亡率，每組重復3次，取其平均值。

1.6.2 殺螺效果指標 感染48 h后，釘螺死亡率超過50%以上的為有效菌株，超過90%以上為強毒株。

1.6.3 數據處理與分析 試驗觀察數據采用SPSS18.0統計軟件進行統計分析，各試驗組間滅螺效果比較采用χ2檢驗法，P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1 滅螺效果觀察

2.1.1 滅螺效果整體觀察 從釘螺孳生土壤中共分離得到細菌96株，經過初篩，篩選出滅螺毒性較高的菌株4株，將其編號為B8、B27、B36、B59。將4株細菌的發酵液、發酵上清液和菌體懸液分別浸泡釘螺24 h、48 h、72 h。滅螺結果顯示：各菌株的發酵液、發酵上清液和菌體懸液對釘螺均表現出不同的毒力，且隨著時間的延長，釘螺的死亡率明顯增加的趨勢。從整體效果觀察得出：發酵上清液滅螺效果最明顯(χ2=21.286，P=0.002)，48 h對釘螺的死亡率高于65%，72 h釘螺的死亡率高于90%；其次為細菌發酵液(χ2=17.298，P=0.008)，48 h釘螺的死亡率達50%以上，72 h釘螺的死亡率高于95%；菌體懸液的殺螺效果最差(χ2=7.579，P=0.271)，48 h釘螺的死亡率低于60%，72 h對釘螺的死亡率低于80%。(表1)

2.1.2 各菌株滅螺效果觀察 細菌發酵液組各組間比較結果：B8菌株與其它菌株之間差異有統計學意義(P<0.01)，B27、B36、B59菌株之間無統計學意義(P>0.05)；發酵上清液組各菌株各組間比較結果：B8-B59組與B36-B59組之間差異有統計學意義(P<0.01)，表明B59菌株滅螺效果優于B8、B36菌株，其它各組之間差異無統計學意義(P>0.05)；菌體懸液組各菌株之間比較結果：B8-B59組間差異有統計學意義(P<0.05)，其它各組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。由以上結果綜合比較得出：B59菌株的滅螺效果優于其它3菌株，B27、B36菌株其次，B8菌株最弱。(表2)

2.1.3 B59菌株各試驗組間滅螺效果比較 B59菌株各試驗組組間釘螺的死亡率比較未顯示出統計學差異，P>0.05)，相對而言發酵上清液效果較好(χ2=5.439，P=0.069) (表3)

3 討 論

從釘螺孳生土壤中分離出4株滅螺效果較好的菌株，4株菌及其代謝產物對釘螺的毒性試驗表明，發酵上清液的毒力最強，48 h對釘螺的死亡率高達65%以上，72 h釘螺的死亡率高達90%以上，說明殺釘螺的有效成分主要在細菌發酵上清液中，這與郭青云等[13]的研究結果是一致的；細菌發酵液的滅螺效果次之，48 h釘螺的死亡率達50%以上，但72 h釘螺的死亡率高達95%以上，細菌發酵液對釘螺的毒力作用可能是由于細菌產生的毒素或其它代謝產物所致，郭丹釗等[14]研究報道SL-30菌株對釘螺的致死性可能是由于影響釘螺的糖代謝或蛋白合成所致；菌體懸液滅螺效果最弱，48 h釘螺死亡率不超50%；研究還發現培養液對照組對釘螺的毒力也比較強，雖然48 h釘螺死亡率不超35%，但72 h后釘螺死亡率高達90%以上，這與郭青云[13]、張桂敏[15]等研究報道不同，其原因可能是隨著時間的延長，發酵液中含有Cl-對釘螺有毒害作用,亦或發酵液的鹽濃度、滲透壓不適合釘螺生存所致，具體原因有待進一步深入分析。

表1 分離菌株各成分浸泡不同時間滅螺效果

表2 菌株不同成分浸泡不同時間滅螺效果組間比較

表3 B59菌株各試驗組間滅螺效果比較

結果表明B59菌株具有較強的滅螺效果。姚超素等[16]道，細菌“673”，0.9億個/mL活菌室內浸泡48 h，感染釘螺2～4 d死亡率可達100%，而B59菌株感染劑量為107個/mL,48 h釘螺的死亡率可達73.3%，其感染劑量、時間及效果均優于細菌“673”；肖瑞芬等[11]報道，自養黃色桿菌感染劑量3×106個/mL，48 h釘螺死亡率57.5%，B59菌株與其相比各有所長。 有關B59菌株的鑒定、分類及其有效代謝產物的分析、鑒定，有待進一步研究。

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Screening and molluscicidal activity of microorganism againstOncomelaniahupensis

CUI Guo-yan1,2,WANG Shi-ping1,CHENG Hong-bing2,HE Xin1,LYUQIU Si-jia1,HUANG Cheng-ming1

(1.DepartmentofParasitology,XiangyaMedicalSchoolCentralSouthUniversity,Changsha410078,China;2.DepartmentofMicrobiology,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China)

We screened the efficient, durable, safe and inexpensive molluscicidal microorganisms againstOncomelaniahupensisand observed the mollusicicidal effects of microorganism in this study. Bacteria with highly toxic toOncomelaniahupensiswere screened from the soil samples of habitat. The bacteria were prepared into bacterial fermented liquor, fermented supernatant and bacteria suspension respectively. The mollusicicidal effects were tested in the experiment base of prevention and control schistosomiasis. The four strains (B8, B27, B36, and B59) which were highly toxic toOncomelaniahupensiswere isolated by preliminary screening. Results of mollusicicidal effects showed that 4 strains of bacteria different components including the fermented liquor, fermented supernatant and bacteria suspension were in different levels of toxicity to snails. According to the comprehensive comparison, B59 strain had the excellent molluscicidal activity. The second ones were B27 and B36 strain. The last one was B8 strain. By the statistical analysis, mollusicicidal effects of the four strains were significant differences (χ2= 21.286,P=0.002). mollusicicidal effect of the four strains were also significantly different (χ2=17.298,P=0.008). mollusicicidal effects of the four strains were not significantly different in the bacteria suspension (χ2=7.579,P=0.271). The fermented supernatant of B59 strain was significantly superior to other strains by mollusicicidal effect analysis.

Schistosomiasis;Oncomelaniahupensis; microorganism; mollusicicidal effect; death rate

Wang Shi-ping, Email: wsp4373383@126.com

國家自然科學基金(No.81271862)和國家科技支撐計劃(No.2009BAI78B05)聯合資助

汪世平， Email: wsp4373383@126.com

1.中南大學湘雅醫學院寄生蟲學教研室，長沙 410078； 2.長治醫學院微生物學教研室,長治 046000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.003

R383.2

A

1002-2694(2015)02-0109-04

2014-10-15；

2014-11-27

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271862) and the National Technological Support Projects of China (No. 2009BAI78B05)