五味子酯乙通過下調Bcl-2表達增強內在耐藥肝癌Bel7402細胞對順鉑誘導的凋亡敏感性

劉小東，張穩穩，鄭小紅

(重慶醫藥高等專科學校 藥學院，重慶 401331)

在腫瘤治療之初存在的和治療過程中逐步形成的腫瘤多藥耐藥(MDR)是當前腫瘤臨床治療中面臨的一大難題。MDR現象的機制眾多，除藥物外排泵ABC轉運蛋白過表達等經典機理外，近年來，研究報道腫瘤干細胞、腫瘤免疫逃逸及藥物誘導腫瘤細胞可塑性改變等新機制也參與了MDR[1]。凋亡和自噬是很多化療藥物最終發揮治療作用清除腫瘤細胞的主要方式，化療藥物在治療過程中的選擇性壓力和某些腫瘤細胞在治療之初存在遺傳因素能誘導凋亡信號通路紊亂，導致腫瘤細胞不能被有序清除，表現為對治療劑量的化療藥物誘導的凋亡不敏感，只有使用更高甚至毒性劑量的藥物才能發揮作用，因此腫瘤細胞凋亡缺陷和凋亡信號通路紊亂也是臨床MDR的常見機制[2-3]。

五味子酯乙為五味子干燥成熟果實的主要藥理活性成分之一[4]，早期研究發現五味子酯乙能通過抑制 P糖蛋白的表達和藥物外排轉運功能逆轉多種耐藥腫瘤細胞的MDR表型,顯著增強化療藥物的抗腫瘤活性，本文旨在研究評價五味子酯乙對順鉑誘導的內在耐藥肝癌Ble7402細胞凋亡敏感的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

五味子酯乙為白色微灰粉末，純度≥99.0%，DMSO配制使用。 MTT(貨號: M2128)、順鉑(貨號：P4394)、細胞裂解液(貨號：C5914)、RPMI-1640培養液(貨號: R2405)、青-鏈霉素雙抗(貨號：V900929)、胰蛋白酶(貨號：T1426)購自sigma公司。胎牛血清(貨號：SH30396.03)購自HyClone公司。Caspase-3(貨號：ab13847)、Bax(貨號：ab53154)、Bcl-2(貨號：ab182858)一抗購自Abcam公司。IRDye680RD二抗(貨號：925-68071)購自基因有限公司。β-actin(貨號：sc-8432)一抗購自Santa Cruz公司。ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡檢測試劑盒(貨號: CA1050)、細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(貨號: G3680)購自索來寶公司。

1.2 細胞培養

人內在耐藥的肝癌Ble7402細胞用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)-鏈霉素(100 μg/mL)的RPMI-1640培養液， 37 ℃、5% CO2Thermo細胞培養箱培養，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。

1.3 MTT

2×103個/孔對數生長期肝癌Ble7402細胞接種于96孔板，貼壁后，順鉑單獨或聯合五味子酯乙作用Ble7402細胞3 d，每孔加入0.5mg/mL MTT 120 μL的RPMI-1640培養液培養4 h，每孔加入DMSO 150 μL，充分震蕩，酶標儀570 nm波長測定OD值。細胞生長抑制率(%)=(1-藥物處理OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 Hoechst 33258染色

1×106個/孔Bel7402細胞接種12孔板內，順鉑單獨或聯合五味子酯乙處理3 d后，棄培養液，PBS緩沖液洗滌3次， 500 μL/孔多聚甲醛PBS液固液孵育0.5 h，吸盡固定液，PBS緩沖液洗滌3次，500 μL/孔33258染液染色10 min，吸除染液，PBS緩沖液洗滌3次，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5 DNA Ladder

收集順鉑單獨或聯合五味子酯乙處理的Bel7402細胞后，加入細胞裂解液(1×106細胞/0.5 mL)，37℃消化24 h，每1×106細胞加入0.5mL Tris苯酚，震蕩混勻，低溫10000 rpm離心10 min，取出酚相的上清液，加50 μL醋酸銨和0.5mL純乙醇，震蕩30 s，低溫凍存60 min，4℃10000 rpm離心15 min，吸取上清液，加等體積75%乙醇，再10000 rpm離心15 min，之后加入60 μL TE液，1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像檢測DNA Ladder。

1.6 PI染色

收集順鉑單獨或聯合不同濃度五味子酯乙處理72 h的細胞，1×PBS 2000g洗3次，75%的乙醇孵育24 h，再離心洗滌一次，用含50mg/L RNase PBS液37℃孵育0.5 h，1×PI染色液室溫孵育1 h，之后避光60 min，流式細胞技術檢測。

1.7 Western blot

RIRA裂解液冰上裂解順鉑單獨或聯合不同濃度五味子酯乙處理Bel7402細胞10 min，4℃、15000 g離心20 min，提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，采用10%聚丙烯酰胺分離膠和5%濃縮膠進行電泳，濕法轉膜，室溫封閉90 min，封閉后的PVDF膜在一抗TBST液(Caspase-3(1∶500)，β-actin(1∶3000)，Bax(1∶2000)、Bcl-2(1∶1500)，將在一抗中4℃孵育過夜，TBST洗膜3～6次，5 min/次，二抗TBST工作液(1∶11000)室溫避光孵育1 h，TBST洗膜3～6次，5 min/次，Odyssey CLx成像系統檢測分析。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 五味子酯乙增強順鉑對內在耐藥的肝癌Bel7402細胞的抗腫瘤活性

如圖1A所示，內在耐藥的肝癌Bel7402細胞對低濃度順鉑不敏感，順鉑(≤2.5μM)單獨作用72 h對Ble7402細胞的增殖無影響(存活率均大于90%)。但與非細胞毒性濃度五味子酯乙(1.0、2.5、5.0 μM)聯用時，可顯著以抑制Bel7402細胞的增殖(P < 0.05,P < 0.01)，且抗增殖作用與五味子酯乙濃度呈劑量依賴性(圖1B)，表明五味子酯乙可劑量依賴性增強順鉑對內在耐藥的Ble7402細胞的抗腫瘤活性。

圖1 (A)順鉑、五味子酯乙單用和(B)順鉑與五味子酯乙聯用對Bel7402細胞增殖的影響,與對照組相比，*P < 0.05,**P < 0.01

2.2 五味子酯乙增強順鉑誘導的Bel7402細胞凋亡的敏感性

如圖2A和B所示，正常細胞核結構完整、染色均勻，順鉑(2.5 μM)和五味子酯乙(5.0μM)單獨作用72 h，Bel7402細胞核形態沒有發生變化，而五味子酯乙與順鉑聯用后，Bel7402細胞核出現典型的凋亡特征性變化(圖2A)，且凋亡細胞的百分率顯著升高(P < 0.01)。此外，如圖2C所示，順鉑(2.5 μM)和五味子酯乙(5.0μM)單獨作用72 h， 未誘導Bel7402細胞出現DNA 片段化條帶，而兩藥聯用可觀察到典型凋亡特征性片段化條帶。這些結果表明五味子酯乙能增強Bel7402細胞對烷化劑順鉑誘導凋亡的敏感性，表現出典型的凋亡形態學特征性。

圖2 (A、B)Hoechst 33258染色和(C)DNA Ladder檢測順鉑、五味子酯乙單用或兩藥聯用對Bel7402細胞凋亡的影響,與對照組相比，**P < 0.01

2.3 五味子酯乙與順鉑聯用對Bel7402細胞周期的影響

如圖3A和B所示，順鉑(2.5 μM)和五味子酯乙(5.0μM)單獨作用72 h，Bel7402細胞未發生凋亡，細胞周期無變化，而五味子酯乙與順鉑聯用后，細胞凋亡率顯著提高(P < 0.01)，細胞周期中各期細胞的百分比顯著變化，其中G0/G1期細胞占比明顯減少(P<0.05)，而S期細胞的百分比則顯著增加(P<0.01)。這些發現進一步提示五味子酯可顯著增強Bel7402細胞對順鉑誘導凋亡的敏感性，并影響細胞周期。

圖3 五味子酯乙與順鉑聯用對Bel7402凋亡率和細胞周期的影響，與對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01

2.4 五味子酯乙與順鉑聯用對Ble7402細胞Caspase-3、Bax和Bcl-2水平的影響

如圖4所示，順鉑(2.5 μM)和五味子酯乙(5.0μM)單獨作用72 h，Bel7402細胞Caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平均無變化，而五味子酯乙與順鉑聯用后，活化的Caspase-3蛋白水平顯著提高(P < 0.01)，但抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平顯著降低(P < 0.05)，提示五味子酯乙與順鉑聯用后顯著降低Bcl-2水平，使得Bax與Bcl-2的比值顯著升高，進而激活Bel7402細胞內的凋亡效應激酶Caspase-3，誘導Bel7402凋亡。

圖4 五味子酯乙與順鉑聯用對Ble7402細胞Caspase-3、Bax和Bcl-2水平的影響，與對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01

3 討論

腫瘤細胞由于遺傳因素或化療藥物等外源因素誘導凋亡缺陷而導致的腫瘤多藥耐藥是腫瘤治療中面臨的一大難題。腫瘤細胞凋亡的調控非常復雜，凋亡通路中的抗凋亡蛋白過表達、促凋亡因子低表達或失活等因素的獨立或聯合作用，常誘使腫瘤細胞對多種臨床常用藥物凋亡敏感性顯著降低，進而形成MDR[5]。所以以紊亂的凋亡通路調控因子(如Bcl-2、Bax、XIAP、IAPs、caspases、p53、蛋白酶體、NF-κB和特異性激酶等)為靶點克服MDR是可行的治療策略[6]。本研究中，無毒濃度五味子酯乙劑量依賴性增強化療藥物順鉑對內在耐藥的肝癌Ble7402細胞的細胞毒性，恢復Ble7402細胞對順鉑誘導的凋亡敏感性，逆轉了內在耐藥的肝癌Ble7402的MDR表型。

Bcl-2家族蛋白主要分為兩大類：抗凋亡蛋白Bcl-2等，促凋亡蛋白Bax等及BH3結構域蛋白。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例平衡和位置變化在腫瘤細胞凋亡缺陷機制中發揮非常重要的作用[7-8]。寡聚化的Bax等可在線粒體外膜形成孔道，允許細胞色素C等釋放到胞漿中級聯激活內源性凋亡通路，而抗凋亡的Bcl-2能中和Bax，阻止線粒體膜通透性增加(MOMP)，抑制線粒體膜細胞色素C等的釋放[9-10]。研究報道，某些腫瘤，如乳腺癌中，Bcl-2蛋白過表達[11]；而另外一些腫瘤中，如血液腫瘤中則發現Bax低表達[12]。本研究中，五味子酯乙與順鉑聯合作用顯著降低G0/G1期細胞、增加S期細胞，且顯著下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平，使得Bax與Bcl-2的比值顯著升高，進而激活Bel7402細胞內的凋亡效應激酶Caspase-3，Bel7402凋亡顯著增加。

綜上所述，五味子酯乙不僅能抑制P糖蛋白的外排功能和表達，還能下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，恢復了促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的平衡，進而促進MOMP，激活內源性凋亡通路，增強內在耐藥肝癌Bel7402對順鉑誘導的凋亡的敏感性，克服凋亡缺陷而逆轉MDR，為五味子酯乙的進一步研究提供了新的理論依據。