ATF4重組慢病毒抑制C2C12細胞增殖并促凋亡

夏 飛，伍志盟，李美玲，鄧 莉，胡 勤，郭風勁

(重慶醫科大學基礎醫學院細胞生物學及遺傳學教研室發育生物學與模式動物平臺，重慶400016)

內質網是蛋白質折疊以及修飾、鈣離子儲存的場所，ATF4(activating transcriptional factor4)是蛋白激酶R 樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)下游的重要信號分子［1］。當內質網中聚集大量錯誤折疊蛋白時，PERK 會進一步被激活，通過磷酸化真核細胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)抑制蛋白質合成［2］，同時通過活化ATF4 上調C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，Chop)基因的表達［3-4］，進而活化細胞凋亡途徑的發生，參與細胞的整合應激反應過程，參與各種代謝異常、組織損傷等病理過程的發生、發展和轉變［5］。

本實驗成功構建和包裝了人ATF4 基因重組慢病毒顆粒，并觀察BMP2 誘導C2C12 成骨分化過程中，ATF4 基因慢病毒修飾對C2C12 細胞增殖和凋亡的影響，為進一步研究人ATF4 基因的生物學功能奠定基礎，也為研究C2C12 成骨分化的分子機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒表達載體pWPT-GFP-V5、慢病毒包裝原件載體pMD2G 和pSPAX2(第二軍醫大學何志穎教授惠贈);HEK-293T 細胞和C2C12 細胞系由本實驗室保存;限制性內切酶BamHⅠ、MluⅠ、Taq 聚合酶和DNA Marker(大連寶生物公司);T4DNA 連接酶(Promega 公司);質粒小量提取試劑盒和DNA 膠回收純化試劑盒(Omega 公司);DMEM 培養基及胎牛血清(Hyclone 公司);ATF4、CHOP 抗體(Santa Cruz公司);Cleaved-Caspase3 抗體(Abcam 公司);p-JNK抗體(Cell Signaling 公司);HRP 標記的抗兔和抗鼠IgG 二抗(北京中杉金橋生物);鼠抗β-actin 單克隆抗體(天津三箭生物技術有限公司);脂質體LipofectamineTM2000(Invitrogen 公司);SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒和ECL 化學發光試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

1.2 ATF4 慢病毒載體的構建

1.2.1 引物設計:根據GenBank 中人ATF4 的CDS區的基因序列……