咪達唑侖與丙泊酚對局灶缺血再灌注大鼠腦水腫影響的對照研究

徐進步，施青山△，許鵬程，王 露,馬艷艷，汪允珍

(1.江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 222000；2.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇徐州 221004)

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·論 著·

咪達唑侖與丙泊酚對局灶缺血再灌注大鼠腦水腫影響的對照研究

徐進步1，施青山1△，許鵬程2，王 露2,馬艷艷1，汪允珍1

(1.江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 222000；2.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，江蘇徐州 221004)

目的 對比咪達唑侖與丙泊酚對腦局灶缺血再灌注后腦水腫狀態(tài)的影響。方法 雄性SD大鼠72只隨機分為四組：假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、丙泊酚處理組、咪達唑侖處理組。采用大腦中動脈線栓法建立局灶性腦缺血模型，缺血2 h再灌注72 h行神經(jīng)功能缺損評分、斷頭取腦行腦梗死體積和腦含水量測量以及腦組織水通道蛋白4(AQP4)表達的檢測。結(jié)果 與缺血再灌注組相比，咪達唑侖與丙泊酚均能明顯降低腦梗死體積，減輕腦水腫，降低AQP4的表達，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 咪達唑侖具有與丙泊酚同等地減輕腦局灶缺血再灌注后水腫的作用，適合作為該類疾病狀態(tài)下的鎮(zhèn)靜藥。

咪達唑侖； 丙泊酚； 缺血再灌注損傷； 腦水腫； 水通道蛋白

丙泊酚與咪達唑侖是公認對腦缺血再灌注損傷有保護作用的兩種鎮(zhèn)靜藥。目前對于兩種藥物腦保護效應(yīng)的對比主要著眼于運動功能評分、神經(jīng)元凋亡、腦梗死面積以及神經(jīng)元的電鏡下形態(tài)等方面[1-3]。關(guān)于兩種藥物哪種更有利于腦缺血再灌注后腦水腫的控制與治療目前尚缺乏較深入的研究。近來研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可以在離體星形膠質(zhì)細胞缺氧-復(fù)氧模型中通過蛋白激酶C途徑下調(diào)水通道蛋白4(AQP4)的表達[4]，提示丙泊酚可以抑制腦缺血再灌注后的腦水腫。然而，咪達唑侖是否具有該功能目前尚無報道。本研究通過對比在大鼠腦局灶腦缺血再灌注后應(yīng)用丙泊酚與咪達唑侖對腦水腫的影響，探討兩種藥物哪種更適用于腦缺血-再灌注患者的鎮(zhèn)靜，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠72只(體質(zhì)量250～280 g，徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供)。實驗前將大鼠置于20 ℃室溫、安靜環(huán)境中飼養(yǎng)，實驗前禁食6 h。

1.2 實驗分組 隨機分為四組(腦缺血再灌注組、假手術(shù)組、丙泊酚處理組、咪達唑侖處理組)，每組動物6只。腦缺血再灌注組采用MCAO模型，栓塞大腦中動脈2 h后恢復(fù)灌注；假手術(shù)組僅行分離手術(shù)，不栓塞大腦中動脈(上述兩組手術(shù)方法見下條說明)；丙泊酚處理組于恢復(fù)再灌注后選擇行為學(xué)評分1分及以上者給予丙泊酚腹腔注射100 mg/kg，2次/天，共3次。咪達唑侖處理組：恢復(fù)再灌注后選擇行為學(xué)評分1分及以上者給予咪達唑侖10 mg/kg腹腔注射，2次/天，共3次。

1.3 材料與試劑 MCAO栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司。免疫印跡用試劑盒采用碧云天生物技術(shù)公司。AQP4二抗購自Santa Cruz Biotechnology Incorporation。

1.4 MCAO模型的制備 參照Longa等[5]的線栓法制作大鼠大腦中動脈阻閉模型動物飼養(yǎng)及手術(shù)室溫控制于25 ℃左右，術(shù)前12 h禁食不禁水，將大鼠以10%水合氯醛35 kg/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺上，取頸正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，頸外動脈和頸總動脈近心端，于頸內(nèi)動脈遠心端備線，在頸總動脈近分叉處剪一約0.2 mm的V形切口，將直徑為0.26 mm的頭端包被多聚賴氨酸的尼龍線經(jīng)該切口順頸總動脈插入頸內(nèi)動脈(18±1)mm，感到有輕微阻力時停止，使大腦中動脈起始部阻塞，扎緊備線并固定栓線，縫合皮膚切口2 h后，將栓線撥出約10 mm 恢復(fù)再灌注。麻醉清醒后觀察出現(xiàn)右側(cè)Horner綜合征，左側(cè)前肢為主的活動障礙判為手術(shù)成功。再灌注72 h后進行行為學(xué)評分和取材行下一步實驗，假手術(shù)組條件同上，置線栓深度為10 mm，麻醉清醒后觀察無右側(cè)Horner綜合征，左側(cè)前肢為主的活動障礙為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 行為學(xué)評分 每組動物均于處死前進行行為學(xué)評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參考Longa 5分制法[5](0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失)。分值越高，說明動物行為障礙越嚴(yán)重。

1.6 腦梗死灶體積測定[6]隨機取各組6只動物過量麻醉后斷頭，將腦組織取出后置于-80 ℃冰箱快速凍冷5 min，去除嗅球、小腦及低位腦干后由前向后冠狀切4刀，片厚約2 mm，置于2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC) 磷酸緩沖液中，37 ℃避光孵育30 min，顯色完全后置10%甲醛溶液固定。因線粒體過氧化氫酶可氧化TTC 故存活組織呈深紅色，梗死組織不著色呈蒼白色。染色后腦片經(jīng)拍照后進行圖像處理,計算梗死灶(蒼白區(qū))范圍,將每一腦片的梗死面積乘以厚度(2 mm)，再將各腦片數(shù)值相加后得到腦梗死灶體積的近似值,取腦梗死體積占全腦體積的百分比作為監(jiān)測指標(biāo)。

1.7 腦含水量測定[6]各組隨機選取6只大鼠，過量水合氯醛麻醉后迅速斷頭取腦，采用干濕重法于缺血側(cè)及缺血對側(cè)取視交叉前2 mm至視交叉后2 mm腦組織約120 mg，包括皮質(zhì)和白質(zhì)，稱取濕重后于85 ℃烤箱中烘烤72 h至恒重后稱取干重按Elliott公式，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8 蛋白印跡(Western Blot)法測定腦組織的AQP4表達[6]余下6只動物過量水合氯醛麻醉后，迅速斷頭取腦，于冰面上分離切取右側(cè)半球視交叉前2 mm至視交叉后2 mm腦組織 液氮迅速凍冷-70 ℃保存待用。標(biāo)本加入含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液手動勻漿后超聲破碎，經(jīng)4 ℃12 000 r/min離心1 h，上清液為胞漿蛋白成分。沉淀再加裂解液，重懸，4 ℃、24 000 r/min離心1 h，重復(fù)兩次，上清液即為實驗所需胞膜蛋白。測濃度后，蛋白煮沸變性，待用。制備SDS-PAGE凝膠，加樣電泳，待溴酚藍電泳至分離膠底部時結(jié)束電泳，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后將NC膜浸入含10%TBST的封閉液中，置于水平搖床上，室溫封閉4 h，將NC膜加入稀釋的AQP4抗體及β-actin抗體中4 ℃過夜，TBST清洗3次，放入稀釋好的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。NBT-BCIP顯色試劑盒顯色。所得蛋白條帶掃描照片，以Photoshop 軟件進行灰度值分析，并按公式(相對值=各處理組條帶灰度值/假手術(shù)組條帶灰度值)計算相對灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 四組大鼠行為學(xué)評分比較 假手術(shù)組行為較正常無變化，缺血再灌注組評分為(2.5±0.8)分，丙泊酚處理組為(1.3±0.5)分，咪達唑侖處理組為(1.3±1.0)分。丙泊酚處理組與咪達唑侖處理組兩組行為學(xué)評分與假手術(shù)組、缺血再灌注組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05)，丙泊酚處理組與咪達唑侖處理組兩組間評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 四組大鼠梗死面積比較 假手術(shù)組無梗死，缺血再灌注組梗死面積為(24.5±3.2)%,丙泊酚處理組梗死面積為(16.1±2.4)%，咪達唑侖處理組梗死面積為(18.7±4.2)%，丙泊酚處理組與咪達唑侖處理組兩組梗死面積較缺血再灌注組明顯降低(P<0.05)，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 四組大鼠腦含水量測定 丙泊酚與咪達唑侖均可以明顯改善腦局灶缺血再灌注后腦水腫，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 四組大鼠腦含水量測定

注：與假手術(shù)組比較,aP<0.05；與缺血組比較,bP<0.05；與對側(cè)比較,cP<0.05。

2.4 四組大鼠腦AQP4表達的影響 Western Blot分析結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組AQP4相對值為2.28±0.28，丙泊酚處理組AQP4相對值為1.44±0.19，與缺血再灌注組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；咪達唑侖處理組相對值為1.60±0.20，與缺血再灌注組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。丙泊酚處理組與咪達唑侖處理組兩組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，缺血再灌注損傷過程中因為腦水腫導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高造成腦疝是缺血性腦卒中患者死亡的重要原因，控制腦水腫也是該類患者早期臨床治療的方向。

腦水腫主要分為血管源性腦水腫與細胞毒性腦水腫。血管源性腦水腫是指由于血腦屏障損害導(dǎo)致其通透性增加造成的腦水腫，主要發(fā)生于創(chuàng)傷、腫瘤、炎癥和低氧等情況；而細胞毒性腦水腫發(fā)生在血腦屏障完整的情況下，主要是由于腦細胞膜上鈉鉀泵的功能障礙，引發(fā)大量水分子進入腦細胞從而導(dǎo)致的腦水腫，主要發(fā)生于中毒、創(chuàng)傷、低氧等情況。在腦局灶缺血后主要發(fā)生的是細胞毒性腦水腫[8]。

反映腦水腫的指標(biāo)除直接測定腦含水量外，還可以由通過AQP的表達變化來監(jiān)測，其中AQP4是哺乳動物腦中調(diào)節(jié)水平衡的最主要的分子。AQP4可以在短時間內(nèi)通過磷酸化調(diào)節(jié)與細胞內(nèi)分布調(diào)節(jié)來改變自身對水分子的通透性，也可以在較長時間內(nèi)通過上調(diào)AQP4的表達來調(diào)節(jié)水分子的進出。在細胞毒性腦水腫，AQP4通過表達上調(diào)造成細胞膜對水分子的通透性增加[9]。因此考察以細胞毒性腦水腫為主要特征的腦局灶缺血再灌注損傷時主要觀察腦內(nèi)AQP4表達的變化。既往研究顯示在腦局灶缺血1 h后使用丙泊酚后處理可以明顯減輕腦水腫，抑制AQP4的表達。其機制可能與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達受抑制有關(guān)[10]。還有研究認為丙泊酚對細胞毒性腦水腫的緩解作用主要是在鋅離子幫助下專屬性抑制AQP4的結(jié)果[11]。

目前，對于咪達唑侖減輕腦水腫的效果尚缺乏實驗研究。本研究通過與丙泊酚對照觀察咪達唑侖對局灶腦缺血再灌注后腦水腫的影響，發(fā)現(xiàn)咪達唑侖與丙泊酚減輕腦水腫的作用無明顯差別，提示咪達唑侖同樣能夠抑制缺血再灌注后腦水腫，且這種作用也是通過AQP4的表達下調(diào)實現(xiàn)的。咪達唑侖腦保護的機制認為一方面它通過作用于GABAA受體減輕谷氨酸堆積所致的神經(jīng)中毒；另一方面它還能通過降低腦代謝率來改善腦的氧供需失衡[3]。而咪達唑侖通過什么途徑調(diào)節(jié)AQP4的表達尚不清楚，其機制尚需進一步研究。

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Comparative study on influences of midazolam and propofol on rat brain edema induced by ischemia/reperfusion injury*

XUJin-bu1,SHIQing-shan1△,XUPeng-cheng2,WANGLu2,MAYan-yan1,WANGYun-zhen1

(1.DepartmentofIntensiveCareMedicine,LianyungangMunicipalSecondPeople′sHospital,Lianyungang,Jiangsu222000,China;2.KeyLaboratoryAnesthesiologyofJiangsuProvince,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221004,China)

Objective To compare the influences of midazolam and propofol on brain edema induced by ischemia/reperfusion(I/R) injury.Methods 72 male Sprague-Dawley(SD) rats were randomized into four groups:sham operation group undergoing sham operation;ischemia/reperfusion group undergoing the thread embolism of the left middle cerebral artery occlusion(MCAO) for 2 h and then removement of thread;propofol treatment group,which accepted propofol treatment on the basis of ischemia/ reperfusion for 72 h;midazolam treatment group,which accepted midazolam treatment on the basis of ischemia/ reperfusion for 72 h.After 72 h of reperfusion the rats were assessed and assigned the neurological deficit scores,then decapitated to evaluate the cerebral infarction volumes,brain water contents and the expression of AQP4.Results In the comparison with the I/R group,both the midazolam treatment group and the propofol treatment group could improve the neurological score,ameliorate brain edema,and down-regulate the expression of AQP4,the differences had no statistical significance(P>0.05).Conclusion Midazolam is equally potent as propofol in ameliorating brain edema induced by I/R injury,and is a suitable sedative for such condition.

midazolam； propofol； ischemia/reperfusion injury； brain edema； aquaporin

蚌埠醫(yī)學(xué)院科研課題計劃(byky13123)。

徐進步，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)專業(yè)。△

，E-mail:sqs003@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.007

A

1672-9455(2015)13-1834-03

2015-01-20

2015-02-25)