應(yīng)用GeXP 遺傳分析系統(tǒng)檢測(cè)病毒性腦炎患兒腦脊液中的人類鼻病毒

王 瓊，林廣裕，高 珺，蔡曉瑩，張銀輝，陳潔玲，陸學(xué)東△

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳 518033；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科，廣東汕頭 515041)

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·論 著·

應(yīng)用GeXP 遺傳分析系統(tǒng)檢測(cè)病毒性腦炎患兒腦脊液中的人類鼻病毒

王 瓊1，林廣裕2，高 珺1，蔡曉瑩2，張銀輝1，陳潔玲2，陸學(xué)東1△

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬福田醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳 518033；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科，廣東汕頭 515041)

目的 探討兒童腦炎與鼻病毒的關(guān)系以及GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)在病毒性腦炎患兒腦脊液人類鼻病毒檢測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值。方法 選擇2012年1～12月因發(fā)熱抽搐等癥狀就診于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科重癥監(jiān)護(hù)室的患兒腦脊液140份，應(yīng)用GeXP遺傳分析系統(tǒng)對(duì)腦脊液標(biāo)本進(jìn)行包括人類鼻病毒在內(nèi)的常見呼吸道病毒篩查，巢式RT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增鼻病毒陽性標(biāo)本，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定和同源性比對(duì)。結(jié)果 GeXP遺傳分析系統(tǒng)共檢測(cè)出6份鼻病毒陽性標(biāo)本，經(jīng)巢式RT-PCR擴(kuò)增、核酸序列測(cè)定和同源性比對(duì)，結(jié)果為鼻病毒C型4份，與GenBank數(shù)據(jù)庫參考序列同源性為95.8%～98.3%。鼻病毒A型和B型各1份，與參考序列同源性分別為96.0%和99.0%。結(jié)論 鼻病毒是引起兒童腦炎的病原之一，GeXP遺傳分析系統(tǒng)為病毒性腦炎的病原學(xué)研究提供快速高通量的檢測(cè)。

鼻病毒； 病毒性腦炎； 兒童； GeXP遺傳分析系統(tǒng)

病毒性腦炎病因復(fù)雜，目前已知可引起腦炎的病毒有130多種，但仍有48%～85%的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性病原不明[1]。人類鼻病毒(HRV)屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，是一組單正鏈的小分子RNA病毒，是成年人和兒童呼吸道感染最常見的病原，有研究發(fā)現(xiàn)HRV與嬰幼兒的熱性驚厥發(fā)作有關(guān)[2]。GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)結(jié)合多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)多達(dá)35個(gè)基因的表達(dá)豐度，具有較高的檢測(cè)靈敏度和特異性，目前已成功應(yīng)用于細(xì)菌氨基糖苷類耐藥基因檢測(cè)、呼吸道病毒和腦炎相關(guān)蟲媒病毒的檢測(cè)等領(lǐng)域[3-5]。本文旨在探討HRV作為病毒性腦炎病原的意義以及GeXP遺傳分析系統(tǒng)在病毒性腦炎患兒腦脊液中HRV檢測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇2012年1～12月因發(fā)熱抽搐等癥狀就診于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科重癥監(jiān)護(hù)室的140份患兒腦脊液標(biāo)本，患兒均于入院24～72 h內(nèi)行側(cè)臥位腰椎穿刺，選擇L4-L5或L3-L4間隙穿刺，留取腦脊液5 mL，其中3～4 mL送常規(guī)生化檢驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)、新型隱球菌培養(yǎng)及抗酸桿菌涂片等檢查，剩余的裝入無菌試管并做好標(biāo)記，置于-80 ℃冰箱中待檢。同時(shí)收集患兒的臨床資料。

1.2 病毒核酸提取 病毒DNA/RNA 提取試劑盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)購于北京全式金生物技術(shù)公司，核酸提取嚴(yán)格按照說明書操作，提取核酸置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 GeXP多重遺傳分析系統(tǒng)進(jìn)行多種呼吸道病毒檢測(cè) 呼吸道病毒多重檢測(cè)試劑盒購于寧波海爾施基因科技有限公司，對(duì)常見呼吸道病毒(流感A、B型，副流感1、2、3型，腺病毒，HRV，人呼吸道合胞病毒，人冠狀病毒，人偏肺病毒，人博卡病毒)進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。病毒核酸的擴(kuò)增程序包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)，反應(yīng)總體積均為10 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：H2O 4.5 μL，5×RT Buffer 2.0 μL，ResV RT primer mix 1.0 μL，Reverse transcriptase 0.5 μL，核酸標(biāo)本 2 μL；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：48 ℃ 1 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)體系：10×RT Buffer 1.0 μL，25 mmol/mL MgCl22 μL，ResV PCR primer mix 1.0 μL，Solution X 1.0 μL，Taq DNA Polymerase 0.35 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 4.65 μL；PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；70 ℃ 1 min。各病毒擴(kuò)增核酸片段大小信息見表1。其中huRNA和huDNA為質(zhì)控核酸提取過程中RNA和DNA完整性的內(nèi)參照，InControl為質(zhì)控RT和PCR反應(yīng)過程的內(nèi)參照。多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳：按19 μL的甲酰胺(SLS)+內(nèi)標(biāo)Marker(DNA標(biāo)準(zhǔn)品SS-400)(100∶1)的比例配制上樣試劑，加入 1 μL PCR 產(chǎn)物，放入GenomeLabTM GeXP 遺傳分析儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳，使用默認(rèn)的分析參數(shù)(Default GeXP Analysis Parameter) 對(duì)毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行片段分析。電泳的試劑和儀器購自美國貝克曼公司。

1.4 巢式RT-PCR擴(kuò)增HRV 針對(duì)HRV 的5′UTR和 VP4/VP2區(qū)設(shè)計(jì)巢式引物，對(duì)經(jīng)GeXP檢測(cè)的HRV陽性標(biāo)本再進(jìn)行巢式RT-PCR擴(kuò)增，引物序列和擴(kuò)增片段大小見表2。引物由Invitrogen(上海)生物公司合成，RT-PCR和PCR擴(kuò)增采用德國Qiagen公司的One step RT-PCR Kit及HotStarTaq Master Mix Kit。采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。RT-PCR反應(yīng)體系：H2O 5.95 μL，5×RT-PCR Buffer 2 μL，OneStep RT-PCR Enzyme Mix 0.4 μL，dNTP Mix 0.4 μL，RNA酶抑制劑 0.05 μL，外巢上游引物0.1 μL，外巢下游引物 0.1 μL，核酸標(biāo)本 1.0 μL；引物工作濃度為10 μmol/L；RT-PCR 反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR反應(yīng)體系：H2O 11 μL，HotStar Taq Master Mix 12.5 μL，內(nèi)巢上游引物 0.5 μL，內(nèi)巢下游引物 0.5 μL，RT-PCR產(chǎn)物 0.5 μL；引物工作濃度為10 μmol/L；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 HRV巢式RT-PCR擴(kuò)增片段序列測(cè)定及同源性比對(duì) 巢式RT-PCR及PCR擴(kuò)增后的HRV陽性產(chǎn)物交Invitrogen(上海)生物公司進(jìn)行核酸序列測(cè)定，所得序列輸入美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫，用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.6 應(yīng)用熒光定量PCR對(duì)HRV陽性標(biāo)本進(jìn)行常見10種腦炎病毒檢測(cè)，總腸道病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16試劑盒購于上海之江科技股份有限公司；乙型腦炎病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、EB病毒、人巨細(xì)胞病毒試劑盒購于廣州華銀醫(yī)藥科技有限公司；腮腺炎病毒、麻疹病毒試劑盒購于北京金豪制藥股份有限公司。均嚴(yán)格按照說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1 GeXP多重呼吸道病毒檢測(cè)結(jié)果 140份患兒腦脊液標(biāo)本中，共檢測(cè)出HRV陽性標(biāo)本6份，其他呼吸道病毒均未檢出。GeXP毛細(xì)管電泳結(jié)果見圖1。陰性標(biāo)本電泳圖中出現(xiàn)3個(gè)內(nèi)質(zhì)控峰，而HRV陽性標(biāo)本中除外3個(gè)質(zhì)控峰，在核酸片段大小為160.68 nt處出現(xiàn)特異的HRV陽性峰。

表1 各病毒擴(kuò)增核酸片段大小信息

注：A為陰性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果；B為HRV陽性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果；橫坐標(biāo)顯示核酸片段大小(nt)，縱坐標(biāo)顯示熒光信號(hào)強(qiáng)度。

圖1 GeXP 多重呼吸道檢測(cè)結(jié)果

注：F out為外巢上游引物；R out為外巢下游引物；F in為內(nèi)巢上游引物；R in為內(nèi)巢下游引物。

2.2 HRV巢式RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)6份GeXP檢測(cè)HRV陽性標(biāo)本應(yīng)用巢式RT-PCR 擴(kuò)增HRV 5′UTR區(qū)218 bp和VP4/VP2區(qū)533 bp的基因片段，其中1份標(biāo)本在兩個(gè)區(qū)域均擴(kuò)增出陽性條帶，4份僅在VP4/VP2區(qū)擴(kuò)增出陽性條帶，1份僅在5′UTR區(qū)擴(kuò)增出陽性條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。

注：A為5′UTR基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；B為VP4/VP2基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；M 為Marker，+為陽性對(duì)照，-為陰性對(duì)照。

圖2 HRV巢式RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖3 HRV陽性株VP4/VP2區(qū)部分核酸片段測(cè)序結(jié)果

2.3 核酸序列測(cè)定和同源性比對(duì)結(jié)果 HRV的PCR產(chǎn)物VP4/VP2區(qū)部分核酸片段測(cè)序結(jié)果如圖3所示，所得序列經(jīng)與GenBank中參考序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果4株為HRV-C型，其中3株與香港株HQ444915同源性為95.8%～96.4%，1株與香港株HQ444822同源性為98.3%，而該株與其它3株HRV-C型的同源性為74.3%～75.7%；另外1株為HRV-A型，與湖南長沙株KF970861同源性為96.0%，1株為HRV-B型，與澳大利亞株KF499392同源性為99.0%。

2.4 腦炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)HRV陽性標(biāo)本進(jìn)行包括總腸道病毒、腸道病毒71型、柯薩奇病毒A16、乙型腦炎病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒、EB病毒等10種常見腦炎病毒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果6份標(biāo)本均為陰性。

3 討 論

病毒性腦炎是由各種病毒侵犯腦實(shí)質(zhì)引起的炎癥，常伴有腦功能紊亂。由于兒童的免疫系統(tǒng)和血腦屏障發(fā)育尚未成熟，病毒性腦炎好發(fā)于兒童。該病有可能損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，預(yù)后不佳，病死率較高，部分存活者可有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。世界范圍內(nèi)已知可引起腦炎的病毒有130多種[1]，因?yàn)橛?jì)劃免疫接種的不斷廣泛和深入，常見的腦炎病毒種類不斷發(fā)生變化，腸道病毒、皰疹病毒是目前我國兒童病毒性腦炎的最主要病原[6]。隨著更多的分子生物學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于病毒性腦炎的病原檢測(cè)，有越來越多的呼吸道病毒也被證實(shí)與腦炎相關(guān)。Huang等[7]對(duì)3 298例咽拭子為腺病毒陽性的患兒進(jìn)行臨床資料分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，109例(3.3%)患兒合并有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，提示中樞系統(tǒng)功能障礙可能是腺病毒感染的嚴(yán)重并發(fā)癥。有研究發(fā)現(xiàn)，部分流感患兒可合并急性腦病，遺留不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[8]。Sánchez-Torrent等[9]從1例3個(gè)月大嬰兒的腦脊液中檢測(cè)出甲型流感病毒H1N1，證明該病毒與嬰幼兒腦炎相關(guān)。Tison-Chambellan 等[10]在對(duì)1例患有腦干腦炎的7歲男孩的腦脊液進(jìn)行PCR分析中檢出呼吸道合胞病毒，證實(shí)呼吸道合胞病毒與腦炎相關(guān)。為探討兒童腦炎與呼吸道病毒的相關(guān)性，本文應(yīng)用GeXP多重遺傳分析系統(tǒng)對(duì)140份發(fā)熱抽搐患兒腦脊液標(biāo)本進(jìn)行呼吸道病毒多重檢測(cè)，共檢出6份HRV陽性標(biāo)本，進(jìn)一步經(jīng)巢式RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序驗(yàn)證，其中4份為HRV-C型，1份HRV-A型，1份HRV-B型。6份腦脊液標(biāo)本經(jīng)10種常見腦炎病毒熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。這6例患兒的平均年齡為18.5個(gè)月，其中5例年齡小于3歲，1例9歲。本次研究提示HRV是引起兒童病毒性腦炎的病原之一，3歲以下嬰幼兒更容易罹患HRV腦炎。本研究6例HRV陽性病例僅有3例(50%)臨床診斷為病毒性腦炎，提示臨床上在無病原學(xué)依據(jù)的情況下易出現(xiàn)誤診漏診。

HRV不但是引起兒童上呼吸道感染的最常見病因，而且能夠引起肺炎、細(xì)支氣管炎和哮喘急性發(fā)作。HRV目前已有血清型達(dá)151個(gè)，基因型分為A型、B型和新近發(fā)現(xiàn)的C型，HRV-C型感染的臨床表現(xiàn)各地報(bào)道不同，香港和澳大利亞的研究主要表現(xiàn)為細(xì)支氣管炎，喘息及哮喘加重，而來自美國的報(bào)道主要為流感樣癥狀，我國學(xué)者的報(bào)道主要以急性上呼吸道感染和支氣管肺炎為主[11]。本次研究中HRV 3種基因型均可引起兒童病毒性腦炎，但以HRV-C型為主，4株HRV-C型的同源性為74.3%～75.7%，存在較大的遺傳變異性。

GenomeLabTM GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)是一種全新的基因表達(dá)譜定量分析平臺(tái)，它將多重PCR 和毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，采用通用引物(上游通用引物標(biāo)記熒光)和特異性嵌合引物相結(jié)合的方法，使嵌合引物和通用引物保持適當(dāng)?shù)谋壤赏ㄓ靡镆龑?dǎo)整個(gè)體系的擴(kuò)增，克服了各靶基因擴(kuò)增效率不一致造成的擴(kuò)增偏愛性，使反應(yīng)體系中各模板的擴(kuò)增效率趨于一致，有效減少多重PCR出現(xiàn)假陰性結(jié)果的概率，從而實(shí)現(xiàn)多重PCR 產(chǎn)物定量檢測(cè)的目的，同時(shí)通過毛細(xì)管電泳可以直接顯示出產(chǎn)物片段長度及相應(yīng)熒光信號(hào)值大小，直觀判斷檢測(cè)結(jié)果。該系統(tǒng)不依賴于特殊反應(yīng)載體，只需常規(guī)RT-PCR試劑、上游熒光標(biāo)記通用引物和毛細(xì)管分離膠等常規(guī)試劑和消耗品，使檢測(cè)成本大為降低。從核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、PCR反應(yīng)到毛細(xì)管電泳，整個(gè)檢測(cè)過程可在8 h內(nèi)完成。本次研究應(yīng)用該系統(tǒng)對(duì)腦脊液標(biāo)本進(jìn)行12個(gè)常見呼吸道病毒篩查，檢測(cè)到的HRV陽性標(biāo)本經(jīng)巢式RT-PCR及測(cè)序確證為HRV感染，提示GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)作為一種快速和高通量的檢測(cè)手段，能夠?yàn)椴《拘阅X炎的呼吸道病毒病原學(xué)研究提供有力支持。

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Application of GeXP genetic analysis system for detecting human rhinovirus in cerebrospinal fluid of children patients with viral encephalitis*

WANGQiong1,LINGuang-yu2,GAOJun1,CAIXiao-ying2,ZHANGYin-hui1,CHENJie-ling2,LUXue-dong1△

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,AffiliatedFutianHospital,GuangdongMedicalCollege,Shenzhen,Guangdong518033,China;2.DepartmentofPediatrics,SecondAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShantouUniversity,Shantou,Guangdong515041,China)

Objective To investigate the relationship between the viral encephalitis in children with human rhinovirus(HRV) and the application value of the GenomeLab Gene Expression Profiler(GeXP) analyzer for the detection of HRV in the cerebrospinal fluid (CSF) of children patients with viral encephalitis.Methods 140 CSF specimens from children patients with convulsions and fever admitted to the pediatric intensive care unit (PICU) of the Second Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University from January 2012 to December 2012 were collected and tested for common respiratory viruses including HRV by using GeXP genetic analysis system.The HRV positive specimens were amplified by nested RT-PCR,and the positive PCR products were sequenced.The resultant DNA sequences were aligned with the reference HRV sequence in GenBank.Results Totally 6 HRV positive specimens were detected by GeXP genetic analysis system.Among them 4 specimens were HRV-C genotypes showing 95.8%～98.3% identity with reference sequences.The others were 1 specimen of HRV-A and 1 specimen of HRV-B genotype which show 96.0% and 99.0% identity with reference sequences respectively.Conclusion HRV is one of the pathogens causing viral encephalitis in children;the GeXP genetic analysis system could be used as a rapid and high throughput detection tool for viral encephalitis etiology research.

human rhinovirus; viral encephalitis; children; GeXP genetic analysis system

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助(201202158)；廣東省深圳市福田區(qū)衛(wèi)生公益性科研項(xiàng)目資助(FTWS201231)。

王瓊，女，研究生，主管技師，研究方向?yàn)槲⑸锛胺肿釉\斷檢驗(yàn)。△

，E-mail：hubiyun180@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.005

A

1672-9455(2015)13-1828-04

2015-01-25

2015-02-20)