雙歧桿菌的脂磷壁酸對巨噬細胞MAPK的影響

李迎雪，宋 洋，姚 君，張 茹

(廣東省深圳市人民醫院消化內科 518020)

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·論 著·

雙歧桿菌的脂磷壁酸對巨噬細胞MAPK的影響

李迎雪，宋 洋，姚 君，張 茹

(廣東省深圳市人民醫院消化內科 518020)

目的 探討雙歧桿菌的脂磷壁酸(LTA)對巨噬細胞絲裂源活化蛋白激酶(MAPK)活性的影響。方法 選取6～8周齡巴比賽(BALB/c)小鼠90只，按隨機數字表達法分為九組，每組10只，A組腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液(PBS)；B組腹腔注射LTA；C組腹腔注射LTA+細胞外調節蛋白激酶(ERK)抑制劑；D組腹腔注射LTA+c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制劑；E組腹腔注射LTA+p38抑制劑；F組腹腔注射LTA+ERK及JNK抑制劑組；G組腹腔注射LTA+ERK及P38抑制劑組；H組腹腔注射LTA+JNK及P38抑制劑；I組腹腔注射LTA+3種抑制劑。九組小鼠注射5 d，每天注射1次，飼養7 d后，處死全部小鼠，采用免疫印跡法檢測九組小鼠腹腔巨噬細胞MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK和JNK蛋白的磷酸化水平。結果 (1)B組小鼠腹腔巨噬細胞ERK1/2蛋白磷酸化水平較A組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組小鼠腹腔巨噬細胞p38MAPK和JNK平均熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)；(2)向小鼠腹腔注射抑制劑的其他七個組別，其相應的蛋白表達水平幾乎為零，且對其他蛋白表達無影響。結論 LTA可能是通過活化巨噬細胞MAPK家族中ERK1/2來激活巨噬細胞表達、合成和分泌細胞因子，抑制劑能夠有效阻斷蛋白表達通路，對其他蛋白表達無影響。

雙歧桿菌； 脂磷壁酸； 巨噬細胞； 絲裂源活化蛋白激酶

雙歧桿菌是黏附于人類腸道最主要的細菌，是有益菌群之一，通過維持機體腸道內菌群平衡來維護宿主的健康[1]。隨著醫療技術和微生物生態學的發展，學者們越來越重視對雙歧桿菌的研究。脂磷壁酸(LTA)是雙歧桿菌細胞壁的重要大分子，也是雙歧桿菌發揮其抗菌、抗衰老、抗腫瘤及調節機體免疫功效的重要結構成分之一[2]。LTA是以1,3磷酸二脂鍵連接的而成的線性磷酸甘油多聚體，是一種無不良反應的調節劑[3]。巨噬細胞MAPK是由脯氨酸介導的絲氨酸、酪氨酸雙重磷化作用的蛋白激酶，ERK1/2和p38MAPK是MAPK信號傳導通路中信號蛋白分子，MAPK對巨噬細胞具有活化、刺激作用，能夠有效地促進巨噬細胞的吞噬能力。研究表明，LTA能夠通過活化NF-кB、AP-1和MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK來激活巨噬細胞信息通道，促使巨噬細胞表達和分泌細胞因子，加強巨噬細胞吞噬能力，增強細胞毒作用，抑制體內多種腫瘤的生長[4-5]。為了解LTA激活巨噬細胞信息通道，分泌細胞因子的機制，筆者做了相關研究，通過觀察小鼠腹腔巨噬細胞MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK和JNK的含量，來研究雙歧桿菌的LTA對巨噬細胞MAPK的影響機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 6～8周齡BALB/c小鼠90只，體質量20～23 g，其中雌鼠45只，雄鼠45只(小鼠購于河南省動物實驗中心)。

1.2 LTA提取 在LB培養基中接種雙歧桿菌，于37 ℃的無氧環境中培養，48 h后裂解，離心并收集上清液。上清液置入50 ℃的水浴鍋中恒溫，待上清液分層后收集上層溶液，用醋酸銨緩沖液洗脫溶液。

1.3 給藥方法 小鼠第1天，空腹注射10%硫乙醇酸鹽肉湯2 mL，第2天起，給予不同試劑。A組注射磷酸緩沖鹽溶液(PBS)0.2 mL,B組腹腔注射LTA；C組腹腔注射LTA +細胞外調節蛋白激酶(ERK)抑制劑；D組腹腔注射LTA+ c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制劑；E組腹腔注射LTA+p38抑制劑；F組腹腔注射LTA+ERK及JNK抑制劑組；G組腹腔注射LTA+ERK及P38抑制劑組；H組腹腔注射LTA+JNK及P38抑制劑；I組腹腔注射LTA+3種抑制劑。1次/天，連用5 d(LTA劑量均為10 μg，3種抑制劑劑量均為0.2 mL，均購于美國Selleck公司)。

1.4 巨噬細胞收集及培養 7 d后，處死小鼠，Hank′s液灌洗腹腔，收集灌洗液。將細胞數調至106/mL，取100 μL細胞懸液置于培養板中，37 ℃下5% CO2孵箱中培養2 h，加入100 μL的10%小牛血清的RPMI1640營養液和終極濃度為10 ng/mL脂多糖(LPS)，培養24 h后，置于-30 ℃環境中保存。

1.5 免疫印跡法檢測九組小鼠p-ERK1/2、p-p38和p-JNK的蛋白表達 離心收集細胞，PBS洗滌3次，加入裂解液，于4 ℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心10 min，吸取上清液。BCA法進行蛋白定量，后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳分離，并將蛋白質轉移到PVDF膜上，成像后分析結果。

2 結 果

2.1 A、B兩組小鼠腹腔內巨噬細胞MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK的蛋白表達水平比較 經LTA刺激后的B組小鼠腹腔巨噬細胞ERK1/2蛋白表達水平較A組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組小鼠腹腔巨噬細胞p38MAPK和JNK蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組小鼠巨噬細胞ERK1/2、p38和JNK蛋白表達水平比較情況

注：與A組比較，*P<0.05。

2.2 B、C、D、E四組小鼠腹腔內巨噬細胞MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK的蛋白表達水平比較 與B組比較，加入ERK抑制劑的C組小鼠，ERK1/2蛋白磷酸化水平幾乎為零；加入JNK抑制劑的D組小鼠，JNK蛋白磷酸化水平幾乎為零；加入p38抑制劑的E組小鼠，p38蛋白磷酸化水平幾乎為零。見表2。

表2 B、C、D、E組小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白表達水平比較

2.3 F、G、H、I 四組小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白磷酸化水平表達比較 F組加入ERK和JNK抑制劑，其ERK1/2和JNK蛋白幾乎為零表達；G組和H組如同F組，加入抑制劑所對應的蛋白磷酸化表達幾乎為零；I組加入3種抑制劑，則ERK1/2、JNK和p38蛋白幾乎為零表達。見表3。

表3 F、G、H、I組小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白表達水平比較情況

3 討 論

雙歧桿菌是動物和人類腸道中重要的生理性有益菌群，維護腸道菌群平衡及機體健康[6-8]。LTA是革蘭陽性菌細胞壁內的重要大分子結構，其親水端參與細菌黏附定值作用，疏水端能夠與細胞膜緊密相連，LTA參與體內免疫調節，抑制腫瘤生長，激活局勢細胞吞噬能力，是無不良反應的生物調節劑[9]。目前研究證實，雙歧桿菌的LTA通過激活巨噬細胞多種信息通道，活化巨噬細胞，增強巨噬細胞吞噬能力，降低消化道疾病發生，也為預防和治療胃腸道疾病提供重要依據，但對LTA促使巨噬細胞表達的機制目前尚未清楚[10]。

ERK通路、p38MAPK通路、JNK/SAPK通路及BMK通路這4條通路路可以介導多種細胞信號，演變為細胞信號轉導的匯聚通路[11-12]。MAPK能夠啟動細胞內信號傳遞系統，介導p38MAPK激活，活化哺乳動物轉錄因子家族(NF-кB)和鐵氧還蛋白轉錄類似因子1(AP-1)，促使巨噬細胞的表達、合成和分泌白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α[13]。相關研究表明，諸多因子如集落刺激因子-1、前列腺素E2以及酵母多糖能夠活化巨噬細胞，其主要途徑是提高ERK1/2、p38MAPKA和AP-1的活性[14-15]。本研究結果顯示，經雙歧桿菌的LTA刺激后的小鼠腹腔巨噬細胞MAPK中ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯要高于注射PBS組，而A組和B組小鼠腹腔巨噬細胞MAPK家族中p38MAPK和JNK水平無明顯差異，加入抑制劑的其他七組，其相應的蛋白磷酸化表達均幾乎為零，這表明雙歧桿菌的LTA通過活化MAPK家族中ERK1/2激活小鼠巨噬細胞表達、合成和分泌細胞因子，以增強巨噬細胞的吞噬能力；抑制劑能夠有效阻斷ERK1/2、JNK和p38通路，且抑制劑不能影響其他蛋白水平表達。但LTA對巨噬細胞MAPK家族中JNK和p38MAPK水平影響不大。

綜上所述，雙歧桿菌的LTA能夠通過活化巨噬細胞MAPK家族中ERK1/2水平，促進巨噬細胞表達、合成和分泌IL-1、IL-6及腫瘤壞死因子-α，增強其殺傷活性和細胞毒作用，為臨床預防和治療消化道疾病提供重要參考依據。

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[2]王玉林，王立生，朱惠明，等．雙歧桿菌DNA對巨噬細胞MAPK的影響[J]．中國微生態學雜志，2005，17(4)：256-257．

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[4]李雪，王義乾，羅海華，等．NF-κB信號通路對BLP耐受巨噬細胞iNOS表達的影響[J]．中國臨床解剖學雜志，2014，3(3)：300-305．

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[9]李迎雪，王立生，荀安營，等．雙歧桿菌的完整肽聚糖對小鼠腹腔巨噬細胞縫隙鏈接的影響[J]．中國微生態學雜志，2008，20(3)：195-196．

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Effects of bifidobacterium lipoteichoic acid on macrophages MAPK*

LIYing-xue,SONGYang,YAOJun,ZHANGRu

(DepartmentofGastroenterology,ShenzhenMunicipalPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518020,China)

Objective To study the influence of bifidobacterium lipoteichoic acid (LTA) on macrophage mitogen activated protein kinase (MAPK) activity of macrophages.Methods 90 BALB/c mice with 6-8 weeks old were selected and randomly divided into 9 groups according to the random number table,10 mice per group.The group A was injected by phosphate buffer solution(PBS);the group B was intraperitoneally injected by LTA;the group C was intraperitoneally injected by LTA + ERK inhibition agent;the group D was intraperitoneally injected by LTA + JNK inhibitor;the group E was intraperitoneally injected by LTA + p38 inhibitors;the group F was intraperitoneally injected by LTA + ERK and JNK inhibitor;the group G was intraperitoneally injected by LTA + ERK and P38 inhibitor;the group H was intraperitoneally injected by LTA + JNK and P38 inhibitors;the group I was intraperitoneally injected by LTA + three kinds of inhibitors.9 groups were injected for 5 d,once a day.After 7 d feeding,the mice all were sacrificed.The phosphorylation levels of ERK1/2,p38MAPK and JNK protein in the peritoneal macrophages MAPK family were detected by using immunoblotting (Western blot).Results (1) The ERK1/2 protein phosphorylation levels of abdominal cavity macrophage in the group B was significantly increased compared with the group A,the difference was statistically significant (P<0.05);the abdominal cavity macrophage p38MAPK and JNK average fluorescence intensity had no statistical difference between these two groups (P>0.05);(2) In the other 7 groups,the corresponding protein expression levels were almost zero,moreover had no effect on the expression of other proteins.Conclusion LTA is probably to activate the macrophages to express,synthesize and secrete cytokines by activating ERK1/2 in macrophages MAPK family,inhibitor can effectively block the protein expression pathway without affecting the expression of other proteins.

bifidobacterium; lipoteichoic acid; macrophages; mitogen activated protein kinase

廣東省深圳市科技計劃項目(201202125)。

李迎雪，女，碩士研究生，主治醫師，研究方向為胃腸病學。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.002

A

1672-9455(2015)13-1821-03

2015-01-20

2015-03-10)