Y染色體無精子癥因子微缺失的篩查與臨床探討

歐妙玲，陳志華，劉麗雅，朱曉丹

(廣東省佛山市婦幼保健院檢驗科 528000)

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·論 著·

Y染色體無精子癥因子微缺失的篩查與臨床探討

歐妙玲，陳志華，劉麗雅，朱曉丹

(廣東省佛山市婦幼保健院檢驗科 528000)

目的 篩查男性不育患者Y染色體無精子癥因子(AZF)微缺失發生率，并分析缺失類型與臨床表型的關系。方法 選取2013年1～12月于佛山市婦幼保健院男科就診的男性不育癥患者200例，其中非梗阻性無精子癥141例，重度少精子癥59例；另選取100例正常孕育男性作為陽性對照；100例正常孕育女性作為陰性對照。采用聚合酶鏈反應分析男性Y染色體AZF微缺失。結果 特發性不育組AZF微缺失率顯著高于非特發性不育組，差異有統計學意義(P<0.05)。在所有AZF微缺失類型中以AZFc最常見，占55.6%；非梗阻性無精子癥組與重度少精子癥組微缺失率及微缺失類型分布情況比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論 Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區微缺失與男性不育具有密切的相關性。

男性不育癥； Y染色體； 無精子癥因子

大約有10%～15%育齡夫婦存在不育情況，其中男性因素大約占了50%，在男性不育中30%是因為遺傳因素所導致。Tiepolo等于1976年發現Y染色體長臂q11區與精子的生成相關，稱之為無精子癥因子(AZF)。之后學者進一步研究確定，AZF包含AZFa、AZFb、AZFc 3個區域，而AZF的缺失與無精子或重度少精子的男性原發性不育具有相關性[1]。聚合酶鏈反應(PCR)具有結果穩定、方法簡便迅速及成本低等優點，其在男性不育癥患者外周血DNA篩查Y染色體微缺失區間等方面逐漸得到推廣應用[2]。本研究對200例不育癥患者Y染色體微缺失進行PCR篩查，分析篩查結果及缺失類型與臨床表型的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1～12月于本院男科就診的男性不育癥患者200例，其中非梗阻性無精子癥患者141例，重度少精子癥患者59例。所有患者均具有正常的男性核型(46，XY)，年齡22～45歲，平均(30.5±5.2)歲。另選擇100例正常孕育男性作為陽性對照；選擇100例正常孕育女性作為陰性對照，分析微缺失情況。根據患者是否存在其他睪丸異常、長期服用棉籽油、腮腺炎病史、精索靜脈曲張、輸精管堵塞等，將200例患者分為特發性不育組和非特發性不育組，其中特發性不育組96例，非特發性不育組104例。

1.2 檢測方法

1.2.1 提取外周血DNA 采用全血細胞試劑盒進行提取，所有操作按照說明書進行；采用紫外分光光度計檢測DNA濃度，提取后于-20 ℃保存。

1.2.2 PCR擴增 采用多重PCR分析AZFa區(UsPgY和sY86)、AZFb區(sYl27和sYl34)、AZFc區(sY254和sY255)3個區6個位點。內對照為sry基因，陽性對照為正常孕育男性，陰性對照為正常孕育女性，空白對照為去離子水。擴增條件：預變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 30 s，退火 59 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，共進行35個循環，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.3 結果確認 電泳后檢測擴增結果發現，AZF缺失的樣本對相應位點進行3次獨立PCR擴增驗證，如仍無目的基因擴增條帶，則確定為該位點缺失。

1.3 結果分析 比較特發性不育組和非特發性不育組的缺失率，以及無精子癥和嚴重少精子癥患者的缺失類型。

1.4 統計學處理 采用SPSS15.0統計學軟件進行數據分析；計數資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；以α=0.05為檢驗水準，以P<0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 特發性不育組和非特發性不育組AZF微缺失率比較 特發性不育組AZF微缺失率[14.6%(14/96)]顯著高于非特發性不育組[3.8%(4/104)]，兩組差異有統計學意義(χ2=5.777，P<0.05)。

2.2 AZF微缺失類型與臨床表型的關系 見表1。非梗阻性無精子癥13例患者發生微缺失，發生率為9.2%(13/141)，嚴重少精子癥5例發生微缺失，發生率為8.5%(5/59)，兩組微缺失發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)。在所有AZF微缺失類型中以AZFc最常見，占55.6%(10/18)。兩組微缺失類型分布情況比較，差異無統計學意義(χ2=2.714，P>0.05)。

表1 AZF微缺失類型與臨床表型的關系[n(%)]

3 討 論

全球不孕不育癥的發生率約為10%～15%，而男性因素大約占到一半。導致男性不育的主要原因包括內分泌紊亂、隱睪、精索靜脈曲張、生殖器炎癥、免疫異常等。基因突變及染色體異常所導致的精子生成障礙在男性不育癥發病中超過30%,但是文獻報道的無精子癥患者染色體核型異常檢出率約為10.5%，主要為47，XXY核型異常。1996年有學者研究發現，精子發生基因位于Y染色體長臂的3個區域，分別為AZFa、AZFb、AZFc區域，并提出每個亞區均與組織病理學相關。1976年研究發現，Y染色體長臂的缺失與精子生成障礙有關，并推測在Yq11上存在Y染色體精子生成相關基因，將此區域命名為“無精子癥因子”。既往的研究主要通過染色體核型分析方法對Y染色體長臂的實際情況進行分析。1994年報道了采用PCR對不育男性外周血DNA Y染色體微缺失區間進行篩查。由于PCR具有結果穩定、方法簡便、成本低等優點，近年來多采用PCR進行研究[3-4]。回顧國內外研究結果顯示，受種族特異性、環境因素等影響，不同種族、不同地區、不同病種患者的微缺失發生率和發生區域不相同。

無精子癥患者因不育而使AZF缺失較少發生代代相傳，但是隨著現代輔助生殖技術的發展，這樣的AZF微缺失很可能通過人為因素而傳給男性后代。通過對Y染色體上的DNA序列標記位點，對嚴重少精子癥和無精子癥患者進行Y染色體上的微缺失進行PCR篩查，對存在微缺失的患者通過胚胎植入前遺傳學診斷，選擇女性胚胎植入，可以避免該微缺失傳給后代，有利于優生優育。同時，在分子水平上找到精子生成障礙的病因，可避免不必要的治療，降低經濟損失及治療對患者造成的痛苦[5]。

既往因Y染色體體積小，含有的基因少，通常認為Y染色體的作用就是區別性別。通過目前的研究，比較確定AZFc區的daz基因家族、AZFb區的rbmyi基因家族、AZFa區的dby、usp9y基因家族與無精子癥有關。關于AZFc區的daz基因家族的研究最早，daz為多拷貝基因，編碼的蛋白質特異性地在睪丸中表達，分布于晚期精細胞和精子的尾部[6]。

本次研究采用PCR檢測Y染色體的微缺失，選擇AZFa、AZFb、AZFc區的缺失熱點，瓊脂糖凝膠電泳紫外線燈下觀察片段的大小簡便易行。在本研究中，伴有AZF微缺失的患者其外周血染色體的核型正常。AZF微缺失可導致精子生成決定基因缺乏，從而造成精子生成障礙。人類Y染色體DNA中存在高度的重復片段，在減數分裂過程中95%不進行重組，基因的這種不穩定性導致基因材料具有較高的自發丟失率[7]。在分析缺失片段的DNA序中發現，產生缺失的斷裂點多位于順向重復序列內。還有學者認為，Y染色體發生微缺失的機制主要是Y染色體在精子發生過程中，胚細胞的快速分裂與卵子發生過程相比具有更多的突變機會，但又不能像常染色體一樣進行DNA修復，且Y染色體基因為單倍體，一個基因缺失就可發生相應的效應。也有學者認為，Y染色體微缺失不依賴于Y染色體出現的背景，是一種隨機事件。卵細胞胞漿內單精子注射技術的發展為男性不育癥的治療帶來了福音，但是其缺點是可能將遺傳缺陷遺傳給下一代[8-11]。

近年來研究結果顯示，不育男性微缺失的發生率差異很大，在1%～55%之間。一方面，這可能與研究設計是否規范，陽性、陰性及空白對照是否合適等有關。本研究對擴增產物存在缺失的患者進行了3次重復的單一引物PCR，從而確保檢驗結果的可靠性。另一方面，所選研究對象的標準和數量不同也會對發生率產生影響。男性不育的原因除了遺傳因素外，還存在比如炎癥、精索靜脈曲張、隱睪等其他原因。本研究中200例患者共有18例發生微因子缺乏，占9.0%，其中無精子癥患者微因子缺失的發生率為9.2%，嚴重少精子癥患者為8.5%，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。此外，選取的序列標記位點(STS)的標記位置、密度不同也會影響檢測結果。有學者認為，無精子癥和嚴重少精子癥患者的Y染色體微缺失發生率與選擇的STS數量的多少無顯著相關性。也就是說，所選擇的STS位點數量與檢驗結果關系不大，而主要需選擇已知的、男性不育患者特異缺失的非多態性位點，同時位于功能候選基因的DNA序列內。本研究對6個缺失的熱點位點進行研究，結果顯示AZFc區最多，占55.6%。

通過對Y染色體微缺失的研究確立Y染色體微缺失基因型與臨床表型的關系，對指導臨床實踐具有重要意義。精子的發生經過“精原細胞-初級精母細胞-次級精母細胞-精子細胞-精子”的過程，其發生過程中有許多睪丸特異性的基因表達，從而產生相關酶類或蛋白分子，對精子的發生進行調控。目前，原癌基因和無精子癥因子基因對精子發生調控作用的研究較為肯定。Yqll上存在AZFa、AZFb及AZFc精子發生相關的位點，它們在男性生殖細胞發育的不同時期發揮作用。AZFa區缺失導致精子阻滯發生在青春期前階段，主要表現為唯塞爾托利細胞綜合征(SCOS)和小睪丸。AZFb區缺失導致精子阻滯發生在青春期減數分裂前、后或者減數分裂期間，初級精母細胞階段。AZFc區缺失可表現為SCOS、單個精母細胞、單個成熟精子及少精子癥等。AZFc區缺失的患者，對睪丸進行多點活檢，有可能發現隱含的具有正常精子的生精小島，進行冷凍可行睪丸精子吸取術。有研究發現，AZFc缺失的少精子癥患者，部分可發展為無精子癥，因此，對這類患者應盡早給予治療，或者將精液冷凍保存。

特發性不育也稱原因不明性不育，指應用現有的診斷手段不能找出不育病因的一種類型，多與遺傳缺陷、基因突變、染色體異常等導致精子發生障礙有關。本研究中特發性不育患者的AZF微缺失率顯著高于非特發性不育患者，由此證實遺傳缺陷是特發性不育的主要病因之一。但是，也有3.8%的非特發性不育患者存在AZF微缺失，說明此類患者也存在AZF微缺失的情況。

綜上所述，Y染色體AZFa、AZFb、AZFc區微缺失與男性不育有密切的相關性。本研究共納入6個基因位點，表明AZF區域與不育癥患者無精子之間存在相關性。但因樣本量及所選基因位點數量的局限，需要增加樣本量及研究位點進行進一步研究。

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Screening and clinical phenotype explore of Y chromosome microdeletions of azoospermia factor in male infertility patients

OUMiao-ling，CHENZhi-hua，LIULi-ya，ZHUXiao-dan

(DepartmentofClinicalLaboratory，MaternalandChildrenHealthHospitalofFoshanCity,Foshan,Guangdong528000,China)

Objective To investigate incidence of Y chromosome microdeletions of azoospermia factor (AZF) in male infertility patients,and to analyze the relationship between types of gene deletion and clinical phenotype.Methods A total of 200 cases of patients with male infertility were recruited in this study from January to December 2013,including 141 cases with non-obstructive azoospermia and 59 cases with severe oligozoospermia.Another 100 healthy males were enrolled as positive control group,and 100 healthy females were enrolled as negative control group.Male Y chromosome AZF microdeletions were analyzed by using polymerase chain reaction method.Results The incidence of AZF microdeletions of idiopathic infertility group was significantly higher than that of non-idiopathic infertility group (P<0.05).In all types of AZF microdeletions,AZFc was the most common type,accounting for 55.6%.No significant differences of AZF microdeletions incidence and distribution of types of AZF microdeletions were found between non-obstructive azoospermia group and severe oligozoospermia group (P>0.05).Conclusion Y chromosome AZFa,AZFb and AZFc microdeletion could be closely correlated to male infertility.

male infertility; Y chromosome; azoospermia factor

歐妙玲，女，本科，主管技師，主要從事細胞遺傳方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.03.031

A

1672-9455(2015)03-0365-03

2014-08-15

2014-10-05)