科瑪嘉顯色培養和API20C AUX鑒定酵母樣真菌的臨床價值

趙琳琳，王江元，艾 清(吉林大學第一醫院二部檢驗科，長春 130031)

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科瑪嘉顯色培養和API20C AUX鑒定酵母樣真菌的臨床價值

趙琳琳，王江元，艾 清△(吉林大學第一醫院二部檢驗科，長春 130031)

目的 探討科瑪嘉顯色培養和API20C AUX(簡稱API20C)鑒定酵母樣真菌的對比研究。方法 收集該院微生物室2012～2013年無菌體液標本分離出的酵母樣真菌121株，對所有菌株進行科瑪嘉顯色培養鑒定和API20C鑒定。通過基因序列分析法將真菌準確鑒定到種。結果 顯色培養基除13株無法鑒定、8株鑒定錯誤外其余菌株均鑒定正確，正確率為92.59% (100/108)。API20C除5株鑒定錯誤、4株無鑒定結果外其余菌株均鑒定正確，正確率為92.56%(112/121)；其中對顯色培養能鑒定菌株的正確率為95.37%(103/108)，對顯色培養無法鑒定菌株的正確率為69.23%(9/13)。結論 科瑪嘉顯色培養和API20C方法對大多數臨床分離菌株能夠準確鑒定到種，API20C對少見真菌和顯色不典型菌種的鑒定有待進一步驗證。

酵母菌； API20C AUX； 顯色培養； 序列分析； DNA

近年來，由于廣譜抗菌藥物的不規范使用、免疫抑制劑的廣泛應用，真菌引起的感染逐年上升[1-2]。有報道顯示白色酵母樣真菌的藥物敏感性高于非白色酵母樣真菌，不同菌種的酵母樣真菌對抗真菌藥物的敏感性和耐藥性不同，所以真菌的準確鑒定對指導臨床用藥尤為重要[3-5]。臨床工作中常用的真菌鑒定方法有科瑪嘉顯色培養法、API20C AUX(簡稱API20C)等生化反應鑒定卡，本研究以分子生物學方法為“金標準”，對科瑪嘉顯色培養和API20C鑒定酵母樣真菌的能力進行評估[6-7]。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集該院微生物室2012年1月至2013年12月無菌體液和血液標本中分離出的酵母樣真菌共121株(已剔除同一患者同一部位或不同部位標本反復檢出的相同菌株)，干濾紙片法-80 ℃保存。

1.2 質控菌株 選取3株標準菌株作為質控菌株：白色假絲酵母菌(ATCC90028)、光滑球擬假絲酵母菌(ATCC90030)、熱帶假絲酵母菌(ATCC1463)，標準菌株均購自衛生部臨床檢驗中心。

1.3 儀器與試劑 LD5-10B低溫離心機(美國賽默飛世爾科技)，T-100 PCR儀(美國Bio-rad公司)，BC-J80S隔水式恒溫培養箱(上海博訊醫療設備廠)。PCR擴增試劑盒(上海生工)，科瑪嘉顯色培養基(法國梅里埃)，API20C AUX鑒定卡(法國梅里埃)。

1.4 真菌顯色培養鑒定 所有菌株接種于沙氏培養基后36 ℃培養24 h，重復1次上述操作，使真菌充分復蘇并分離出單個菌落。挑取沙氏培養基上的單個菌落接種于科瑪嘉顯色培養基，36 ℃培養72 h后判定結果(每24 h觀察1次顯色情況)：綠色、翠綠色菌落為白色假絲酵母菌；藍灰色、鐵灰色菌落為熱帶假絲酵母菌；粉紅色模糊有微毛菌落為克柔假絲酵母菌；紫紅色光滑菌落為光滑球擬假絲酵母菌；顯色不典型和白色菌落為無法鑒定的其他假絲酵母菌。

1.5 真菌API20C鑒定 配制所有菌株的菌懸液(2.0 Mac)，取100 μL菌懸液至API C Medium培養基，混均后加入API20C真菌鑒定試劑條，29 ℃培養48～72 h后與陰性孔對照，閱讀生化譜。生化譜輸入API20C 3.0系統進行結果判讀：鑒定百分率≥80%且T≥0為“可接受的鑒定”，鑒定百分率<80%為“無鑒定結果”。

1.6 分子生物學鑒定 采用直接煮沸法提取真菌DNA，選取真菌通用引物ITS1、ITS4進行PCR擴增[6-7]。PCR體系為50 μL：PCR Master 25 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各2 μL，無菌雙蒸水至50 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環；最后72 ℃延伸8 min。DNA擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工測序，測序結果提交GenBank數據庫進行序列分析，從而將所有菌株準確鑒定到種。

2 結 果

2.1 質量控制 3株標準菌株白色假絲酵母菌(ATCC 90028)、光滑球擬假絲酵母菌(ATCC 90030)、熱帶假絲酵母菌(ATCC 1463)通過科瑪嘉顯色培養、API20C、基因序列分析法均能準確鑒定至種。見圖1。

2.2 顯色培養鑒定結果 顯色培養基僅能鑒定4種常見的酵母樣真菌，有13株無法鑒定，鑒定率為89.26%(108/121)，與國內有關文獻報道一致[8]。其中108株菌株的鑒定結果中有8株與基因序列分析結果不符，正確率為92.59%(100/108)。

2.3 API20C鑒定結果 13株顯色無法鑒定菌株經API20C鑒定，除1株近平滑假絲酵母菌和2株葡萄牙假絲酵母菌鑒定錯誤、1株白色假絲酵母菌無鑒定結果外，其余菌株均鑒定正確，正確率為69.23%(9/13)。108株顯色鑒定至種菌株經API20C鑒定，除1株白色假絲酵母菌和1株熱帶假絲酵母菌鑒定錯誤、1株季也蒙假絲酵母菌和2株熱帶假絲酵母菌無鑒定結果外，其余菌株均鑒定正確，正確率為95.37%(103/108)。API20C的總正確率為92.56%(112/121)，接近國內相關文獻報道[9]。見表1。

注：1表示白色假絲酵母菌(ATCC 90028)；2表示熱帶假絲酵母菌(ATCC 1463)；3表示光滑球擬假絲酵母菌(ATCC 90030)。

圖1 標準菌株顯色結果

注：括號內為菌株數。

3 討 論

本研究以分子生物學方法鑒定結果為金標準，對科瑪嘉顯色培養和API20C的鑒定能力進行評估。從菌種庫中選取的少見菌種的菌株比例常較臨床分離菌株高，這與臨床實際情況不符。本研究菌株收集2012年1月至2013年12月臨床無菌體液和血液標本中分離出的不同患者的全部酵母樣真菌，在菌種構成上與臨床符合，因此得出的結果更能反映顯色培養和API20C在臨床應用中的價值。

顯色培養基鑒定結果顯示，8株菌株顯色培養錯誤鑒定，顯色培養可鑒定菌種內的2株常見菌株無法鑒定，可能原因：(1)個人顏色辨別能力不同。如藍灰色、藍紫色、紫紅色辨別的差異。(2)常見菌株在科瑪嘉顯色培養基上顯色不典型。如本組顯白色的白色假絲酵母菌和顯橘紅色的光滑球擬假絲酵母菌，這2株菌株在顯色培養基可鑒定至菌種，但顯色培養基均無法鑒定。(3)少見菌株顯出與常見菌株相似的顏色。如1株葡萄假絲酵母菌和1株季也蒙假絲酵母菌均顯示紫紅色，易錯誤鑒定為光滑球擬假絲酵母菌；1株阿薩希絲孢酵母顯出綠色，易錯誤鑒定為白色假絲酵母菌。API20C鑒定結果表明，有9株菌株鑒定錯誤或無鑒定結果，其中包括6株常見菌株(2株白色假絲酵母菌、3株熱帶假絲酵母菌和1株近平滑假絲酵母菌)，原因可能為：(1)廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑的應用使菌株的生化反應不再典型。(2)菌株的生長狀態不同，生化反應結果不同。科瑪嘉顯色培養基鑒定正確率為92.59%，API20C鑒定酵母樣真菌的總正確率為92.56%，說明科瑪嘉顯色培養基和API20C能夠將大多數臨床分離菌株準確鑒定到種。但是臨床工作中對顯色培養可以鑒定的菌株不再進行API20C的鑒定，所以應該更加注重API20C對顯色無法鑒定菌株的鑒定能力的評估。本研究中顯色無法鑒定的13株菌株經API20C鑒定，3株鑒定錯誤，1株無鑒定結果，鑒定正確率僅為69.23%(9/13)，低于API20C的總鑒定正確率。但本研究中顯色無法鑒定菌株標本量少，所以API20C對臨床分離的顯色無法鑒定的少見真菌和顯色不典型菌株的鑒定能力有待進一步驗證。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.044

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1672-9455(2015)11-1602-02

2014-12-25

2015-02-15)

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