SMAD家族成員4 shRNA干擾慢病毒構建與分析

李忱煒(重慶市渝北區人民醫院檢驗科 401120)

?

SMAD家族成員4 shRNA干擾慢病毒構建與分析

李忱煒(重慶市渝北區人民醫院檢驗科 401120)

目的 制備shRNA干擾人SMAD家族成員4(SMAD4)的慢病毒載體(shRNA-SMAD4)，為深入研究BMPs/SMAD信號通路奠定基礎。方法 利用在線干擾設計網頁進行干擾引物設計，根據小干擾RNA的設計原則，選取3對針對SMAD4特異性干擾引物而合成。合成的片段連接到慢病毒載體質粒pSIH1-H1，形成pSIH1-H1-shRNA-SMAD4質粒。用PCR及測序對其鑒定，然后與慢病毒包裝質粒混勻，由脂質體轉染至HEK293T細胞進行包裝，產生慢病毒shRNA-SMAD4，并收集上清液感染乳腺癌MDA-MB-231細胞，通過RT-PCR及Western Blot鑒定重組慢病毒干擾效果。結果 (1)shRNA干擾SMAD4特異性引物的獲得。(2) pSIH1-H1-shRNA SMAD4質粒經PCR驗證和測序后，證實構建成功。(3) shRNA-SMAD4在HEK293T中重組成慢病毒，并成功感染MDA-MB-231。(4)shRNA-SMAD4感染乳腺癌MDA-MB-231細胞后SMAD4的表達降低。結論 成功構建shRNA-SMAD4慢病毒載體，并能有效抑制SMAD4表達。

慢病毒載體； 短發卡RNA； SMAD家族成員4

乳腺癌是一類易發生轉移的腫瘤，近年來研究發現骨形態發生蛋白(BMPs)作為轉化生長因子-β(TGF-β)超家族成員,在乳腺癌的生長、侵襲、遷移中起著重要作用[1]。本組前期研究和文獻報道均表明，BMPs/SMAD參與乳腺癌MDA-MB-231生長、侵襲、遷移過程,而且BMPs/SMAD在MDA-MB-231中處于激活狀態[1]。骨形態發生蛋白7(BMP7)和骨形態發生蛋白9(BMP9)作為乳腺癌的負性因子能夠抑制MDA-MB-231生長、侵襲、遷移以及轉移過程，有研究還發現BMP9能抑制MDA-MB-231的骨轉移過程[2]。但MDA-MB-231中內源性BMP7和BMP9未見其表達或表達明顯降低。MDA-MB-231作為一株惡性程度較高的三陰性乳腺癌細胞株，抑制其處于激活狀態的BMPs/SMAD通路會對MDA-MB-231的生長、侵襲、遷移中起各種調節作用。SMAD家族成員4(SMAD4)作為BMPs/SMAD這一信號通路的中間環節，對信號通路調控起著重要作用[3-4]。如下調SMAD4表達，抑制BMP/SMAD參與MDA-MB-231的生長、侵襲、遷移過程，MDA-MB-231的惡性程度是否明顯降低。本研究通過美國SBI公司第4代慢病毒包裝系統，構建SMAD4慢病毒表達載體，為乳腺癌轉移分子機制奠定基礎，從而有效治療乳腺癌。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 pSIH1-H1質粒和慢病毒包裝質粒pPACKH1購自美國SBI公司。大腸埃希菌STBL-3菌種以及人胚腎HEK293T細胞，由重慶醫科大學臨床檢驗診斷學實驗室提供。

1.2 主要試劑 Trizol，脂質體2000轉染試劑盒(Life公司)；DMEM 高糖培養基，胎牛血清(Hyclone公司)；干擾引物(Invitrogen上海生物技術有限公司合成)；限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ，T4連接酶(New England Biolab公司)；DNA純化試劑盒(Omega公司)。

1.3 方法

1.3.1 SMAD4干擾引物設計與合成 將人SMAD4的mRNA基因(GenBank序列號為NM_005359.5)CDS區輸入至Life RNA在線設計干擾網頁中，按照小干擾RNA的設計原則，選取3對干擾引物作為實驗組，同時設計1對完全隨機引物作為陰性干擾對照組，將選取的干擾引物按照shRNA的構成原則，中間以TCAAGAG為頸環結構，并在2端添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點。合成的DNA分別命名為shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive。

1.3.2 干擾質粒PCR驗證引物設計 SMAD4干擾質粒PCR驗證上游引物：5′-AAT GTC TTT GGA TTT GGG AAT CTT AT-3′;下游引物：5′-TGG TCT AAC CAG AGA GAC CCA GTA-3′，未插入干擾片段質粒擴增長度105 bp，插入干擾片段后質粒擴增長度為161 bp。SMAD4 PCR上游引物：5′-CTG GAC TGG AAG TAG GAC-3′；下游引物：5′-AAG TAA GCA ATG GAA CAC-3′，擴增長度186 bp。GAPDH上游引物：5′-CAG CGA CAC CCA CTC CTC-3′；下游引物：5′-TGA GGT CCA CCA CCC TGT-3′，擴增長度120 bp。

1．3.3 2種基因與載體pSIH1-H1的連接 BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pSIH1-H1質粒，酶切產物經純化試劑盒純化，DNA連接試劑盒連接，shRNA-SMAD4基因采用連接產物命名為pSIH1-H1-shRNA-SMAD4，shRNA-Negtive基因使用連接產物命名為pSIH1-H1-shRNA-Negtive。

1.3.4 pSIH1-H1-shRNA-SMAD4和pSIH1-H1-shRNA-Negtive質粒的鑒定 連接產物經Cacl2化轉入STBL-3菌株，接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養過夜后挑取單個菌落，加入至3 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基，37 ℃，220 r/min搖床培養12 h將菌液擴大培養后提取質粒，5 μL菌落PCR鑒定，10 μL送南京金斯瑞有限公司測序。

1.3.5 shRNA干擾慢病毒的包裝和病毒上清液收集 將構建好并測序正確的干擾質粒和慢病毒包裝質粒按慢病毒包裝質粒試劑盒混勻，并與Lipofectamine 2000轉染入HEK293T細胞，37 ℃、5% CO2的飽和濕度細胞培養箱培養，觀察熒光表達量，至48 h后收集細胞培養液，離心后獲取上清液至無菌EP管備用。

1.3.6 重組干擾慢病毒在MDA-MB-231的感染以及干擾效果測定 將包含病毒顆粒的培養液加入至MDA-MB-231，24 h觀察慢病毒感染熒光表達情況，并提取細胞總RNA，干擾慢病毒48 h后提取細胞總蛋白，觀察mRNA和蛋白水平干擾效果。

2 結 果

2.1 shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive引物序列 根據Ambion在線設計干擾引物網頁，點擊干擾片段設計，遵循干擾RNA設計原則,選取其中3對作為SMAD4干擾靶序列，設計合成shRNA引物。見表1。

表1 3對shRNA干擾引物和陰性對照引物序列

2.2 shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive的鑒定 構建完成的質粒經PCR初步鑒定后，擴增出相應條帶，認為質粒初步構建成功，立即送公司測序，經測序后進行序列比對，確定質粒是否構建成功。經PCR初步驗證后在105 bp有條帶，認為連接成功，送公司測序并將測序結果進行比對后，證明質粒完全構建成功。見圖1、2。

圖1 shRNA-SMAD4-1PCR檢測結果圖

圖2 shRNA-SMAD4-1的測序比對圖

2.3 shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive慢病毒的包裝和病毒收集 shRNA-SMAD4、shRNA-Negtive和慢病毒載體混勻后，經脂質體轉染入人HEK293T細胞，48 h后收集細胞上清培養液，離心去除細胞碎片后，收集病毒液(以shRNA-SMAD4-2和shRNA-Negtive舉例說明)。加入直徑6 cm鋪有細胞密度60%～80%的MDA-MB-231培養皿中，24 h觀察熒光表達，表達量約為60%，見圖3。

圖3 shRNA-Negtive熒光表達圖(×100)

2.4 shRNA-SMAD4和shRNA-Negtive在mRNA和蛋白水平的表達 慢病毒感染MDA-MB-231后，24 h提取細胞總RNA,48 h提取細胞總蛋白。通過聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和免疫印跡試驗(Western-blot)檢測SMAD4干擾慢病毒的干擾效果。慢病毒感染24 h后，感染率均值約60%。RT-PCR顯示shRNA-SMAD4-1、shRNA-SMAD4-2和shRNA-SMAD4-3組細胞SMAD4 mRNA 的表達較shRNA-Negtive組均有所降低，分別降低52.17%、46.33%、40.18%。表明shRNA-SMAD4-3的干擾效果最好，且得到Western-blot進一步證實。本組實驗結果提示，干擾慢病毒載體構建成功。見圖4。

注：1：shRNA-Negtive；2：shRNA-SMAD4-1；3：shRNA-SMAD4-2；4：shRNA-SMAD4-3。

3 討 論

腫瘤的發生發展是一個多因素作用、多基因參與的復雜生物學過程，目前其機制尚未完全明了。乳腺癌作為女性常見的惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤的第1位。目前有文獻報道BMPs/SMAD在乳腺癌的生物學過程中起著重要作用，Katsuno等[5]研究發現骨形態發生蛋白2(BMP2)通過BMPs/SMAD通路促進MDA-MB-231侵襲遷移。BMP2在體內外能夠促進雌激素受體陽性的MCF7侵襲遷移，過表達BMP2的MCF-7細胞復制乳腺癌異種移植瘤，裸鼠動物模型中發現有明顯新生血管形成[6]。Liu等[7]結合臨床標本和實驗數據提出SMAD4可作為乳腺癌的診斷指標。Xue等[8]研究表明SMAD4作為一關鍵分子參與腫瘤轉移過程，Flanders 進一步證實這一結果。大量研究提示SMAD4在乳腺癌的發生、發展中起著重要作用，深入研究SMAD4的功能對闡明乳腺癌發病機制具有臨床價值[9-10]。

本組通過SBI公司第4代慢病毒包裝系統，利用干擾在線設計網頁，設計3對針對SMAD4的短發卡RNA，并成功包裝成干擾慢病毒。經RT-PCR和Western-blot發現3對短發卡RNA對SMAD4均有干擾效果，shRNA-SMAD4-1(52.17%)、shRNA-SMAD4-2(46.33%)、shRNA-SMAD4-3(40.18%)。shRNA-SMAD4-3干擾效果最好，干擾慢病毒的成功構建為后續研究SMAD4功能作出良好鋪墊工作。

慢病毒病毒載體作為一種有效的基因工程載體，已證實其可用于基因治療、免疫治療及基礎生物學研究的有力工具。作為基因載體，其具有較多優點，如可以制備較高滴度慢病毒，所攜帶的基因表達水平高，所感染的宿主細胞和組織范圍廣，幾乎可以干擾所有細胞，慢病毒可以整合到基因組，能夠形成穩定的基因表達，今后可用于獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、神經系統疾病、血液系統疾病的基因治療。本實驗采用SBI安全性更高的第4代慢病毒包裝系統，為以后的實驗研究奠定了良好的基礎。

[1]Ye S,Park BH,Song KJ,et al.In vivo inhibition of bone morphogenetic protein-2 on breast cancer cell growth[J].Spine (Phila Pa 1976)，2013,38(3):143-150.

[2]王科,馮紅蕾,孫笑笑,等.骨形態發生蛋白9對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖和凋亡的影響[J].腫瘤,2011,31(5):389-394.

[3]Yang Y,Wolfram J,Shen J,et al.Live-cell single-molecule imaging reveals clathrin and caveolin-1 dependent docking of SMAD4 at the cell membrane[J].FEBS Lett，2013,587(24):3912-3120.

[4]Yu SL,Lee DC,Son JW,et al.Histone deacetylase 4 mediates SMAD family member 4 deacetylation and induces 5-fluorouracil resistance in breast cancer cells[J].Oncol Rep，2013,30(13):1293-1296.

[5]Katsuno Y,Hanyu A,Kanda H,et al.Bone morphogenetic protein signaling enhances invasion and bone metastasis of breast cancer cells through Smad pathway[J].Oncogene,2008,27(49):6322-6333.

[6]Clement JH,Raida M,Snger J,et al.Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) induces in vitro invasion and in vivo hormone independent growth of breast carcinoma cells[J].Int J Oncol，2005,27(5):401-407.

[7]Liu NN,Xi Y,Callaghan MU,et al.SMAD4 is a potential prognostic marker in human breast carcinomas[J].Tumour Biol，2014,35(10):641-650.

[8]Xue J,Lin X,Chiu WT,et al.Sustained activation of SMAD3/SMAD4 by FOXM1 promotes TGF-β-dependent cancer metastasis[J].J Clin Invest.，2014,124(4):564-579.

[9]姜晶,王彩芹,劉楠楠.Smad4在乳腺癌及癌周組織中的表達及意義[J].中國老年學雜志,2014,14(15):1253-1255.

[10]Flanders KC,Heger CD,Conway C,et al.Bright field proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein smad signaling complexes in tissue sections[J].J Histochem Cytochem,2014,20(22):1554-1556.

SMAD4 shRNA interference lentivirus build and analysis

LiChen-wei

(ThePeople′sHospitalofChongqingYubeiDistrict,Chongqing401120,China)

Objective To construct the recombinant Lentivirus vector interfering human SMAD4 gene for the further research of BMPs/SMAD cell signal.Methods ShorthairpinRNA (shRNA) targeting SMAD4 gene was designed and DNA template was synthesized and subcloned into the Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1.The recombinant plasmid pSIH1-H1-shRNA-SMAD4 was confirmed by PCR and gene sequencing.Then pSIH1-H1-shRNA-SMAD4 and Lentiviral packaging plasmid was transfected into HEK293 cells for packaging by liposome.And collected Supernatant culture medium medium to infected MDA-MB-231 breast cancer cells.shRNA-SMAD4 was identified by RT-PCR and Western blot.Results (1) The gene sequence of shRNA targeting SMAD4 gene was obtained.(2)The recombinant Lentivirus expression plasmid pSIH1-H1-shRNA-SMAD4 and were successfully constructed.(3)The recombinant Lentivirus vector shRNA-SMAD4 could be packaged in HEK293T and infected MDA-MB-231 Successfully.(4) The expression of SMAD4 gene was reduced in the breast cancer MDA-MB-231cells infected by shRNA-SMAD4.Conclusion The recombinant Lentivirus vector shRNA-SMAD4 was successfully constructed which could inhibit the expression of SMAD4.

recombinant lentivirus vector； shRNA； human SMAD4

李忱煒，男，碩士，檢驗技師，主要從事細胞信號通路、肺炎鏈球菌致病機制研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.11.035

A

1672-9455(2015)11-1582-03

2014-12-15

2015-02-08)