習(xí)慣性流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜中Treg/Th17免疫失衡的檢測(cè)及其臨床意義*

楊小猛,趙 丹,杜麗偉,唐瓊玲,蔣淑萍,陳 相,陳書恩,姜艷華(.深圳市羅湖區(qū)婦幼 保健院檢驗(yàn)科 5809；.深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院檢驗(yàn)科 580；.深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科 5809)

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·論 著·

習(xí)慣性流產(chǎn)患者絨毛和蛻膜中Treg/Th17免疫失衡的檢測(cè)及其臨床意義*

楊小猛1,趙 丹2,杜麗偉1,唐瓊玲1,蔣淑萍1,陳 相1,陳書恩1,姜艷華3(1.深圳市羅湖區(qū)婦幼 保健院檢驗(yàn)科 518019；2.深圳市羅湖區(qū)慢性病防治院檢驗(yàn)科 518023；3.深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科 518019)

目的 探討絨毛和蛻膜中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)/Th17免疫失衡在習(xí)慣性流產(chǎn)(RSA)患者免疫發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 收集RSA患者和自愿終止妊娠的早孕婦女(正常對(duì)照組)的絨毛和蛻膜，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其中Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量，采用RT-PCR檢測(cè)其中叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)和維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(RORγt)的mRNA水平；收集RSA患者和正常對(duì)照組的外周血，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、白細(xì)胞介素(IL)-10、IL-17A和IL-17F的水平；統(tǒng)計(jì)分析Treg細(xì)胞和其相關(guān)細(xì)胞因子、Th17細(xì)胞和其相關(guān)細(xì)胞因子之間的相關(guān)性。結(jié)果 和正常對(duì)照組比較，RSA患者絨毛和蛻膜中Th17細(xì)胞明顯增多(均P<0.01)，Treg細(xì)胞明顯減少(均P<0.01)，RORγt的mRNA水平明顯升高(均P<0.01)，F(xiàn)oxp3的mRNA水平明顯降低(均P<0.01)；RSA患者外周血中IL-17A和IL-17F水平明顯升高(均P<0.01)，TGF-β和IL-10水平明顯降低(均P<0.01)；RSA患者和正常對(duì)照組Treg細(xì)胞數(shù)量和TGF-β及IL-10水平、Th17細(xì)胞數(shù)量和IL-17A及IL-17F水平均呈正相關(guān)(均P<0.01)。結(jié)論 絨毛和蛻膜中Treg/Th17免疫失衡可能與RSA的免疫發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

習(xí)慣性流產(chǎn)； Treg/Th17平衡； 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β； 白細(xì)胞介素-10； 白細(xì)胞介素-17A； 白細(xì)胞介素-17F

習(xí)慣性流產(chǎn)(RSA)是一種由母胎免疫耐受失衡引起的疾病，育齡婦女中發(fā)病率約為1%～5%。RSA的病因十分復(fù)雜，一般認(rèn)為與遺傳、解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌、免疫、感染和環(huán)境因素等有關(guān)；除此之外尚有50%～60%的患者病因不明[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和Th17細(xì)胞是不同于Th1和Th2的CD4+T細(xì)胞亞群。Treg細(xì)胞表達(dá)叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)，是一種下調(diào)免疫應(yīng)答的細(xì)胞，可通過(guò)接觸抑制或分泌白細(xì)胞介素(IL)-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)發(fā)揮維持自身免疫耐受和抗炎的功能；Th17細(xì)胞表達(dá)維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt(RORγt)，主要分泌IL-17A和IL-17F，可能在自身免疫性疾病、炎癥和腫瘤等多種免疫性疾病中起重要作用[2]。Treg/Th17平衡失調(diào)與多種疾病有關(guān)[3]，而其與RSA的關(guān)系尚不明了[4]。因此，本研究將檢測(cè)RSA患者絨毛和蛻膜中Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量、Foxp3和RORγt的mRNA水平，以及RSA患者外周血中TGF-β、IL-10、IL-17A和IL-17F等細(xì)胞因子水平，探討絨毛和蛻膜中Treg/Th17數(shù)量和功能平衡與RSA的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 RSA患者(孕周為8～10周)30例，年齡為22～38歲，平均32歲，其診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]。30例自愿終止妊娠的早孕婦女(孕周為8～10周)為正常對(duì)照組，年齡為23～38歲，平均31歲。兩組患者均為2013年9月至2014年5月在深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科門診就診患者。正常對(duì)照組婦女無(wú)不良妊娠史，無(wú)遺傳、解剖結(jié)構(gòu)和內(nèi)分泌異常，無(wú)自身免疫性疾病史。兩組研究對(duì)象年齡和孕周差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，所有入選對(duì)象均簽訂知情同意書。

1.2 儀器與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，TRIzol試劑盒、隨機(jī)引物和RNaseH反轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，佛波脂和離子霉素為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，固定破膜液為美國(guó)BD公司產(chǎn)品，細(xì)胞因子ELISA試劑盒、PE標(biāo)記的抗IL-17A單抗、PE-Cy5標(biāo)記的抗Foxp3單抗、PE標(biāo)記的小鼠IgG1和PE-Cy5標(biāo)記的小鼠IgG1均為美國(guó)eBioscience公司產(chǎn)品，SYBR Premix Taq試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自深圳達(dá)科為公司。Coulter EPICS-XL型流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司產(chǎn)品，ABI7300型熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，MK3型酶標(biāo)儀為美國(guó)賽默飛世爾產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 絨毛和蛻膜單個(gè)核細(xì)胞制備 收集所有入選對(duì)象的絨毛和蛻膜，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗去除黏液和血液。無(wú)菌條件下剪碎組織，加入0.25%的胰酶-EDTA(pH8.0)于37 ℃消化1 h，獲得細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液中加入淋巴細(xì)胞分離液于500×g離心30 min獲得絨毛單個(gè)核細(xì)胞和蛻膜單個(gè)核細(xì)胞，并用PBS洗兩遍。為測(cè)定Th17細(xì)胞，將上述單個(gè)核細(xì)胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液中(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、2 mmol/L谷氨酸和10%熱滅活的胎牛血清)，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106/mL。加入50 ng/mL佛波脂、1 μmol/L離子霉素和1 μL/mL莫能霉素，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)4 h，備用。為測(cè)定Treg細(xì)胞，將上述單個(gè)核細(xì)胞懸液直接備用。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)絨毛和蛻膜中Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量 佛波脂和離子霉素下調(diào)T細(xì)胞表面CD4分子的表達(dá)，因此本實(shí)驗(yàn)以CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞定義Th17細(xì)胞；而Treg細(xì)胞被定義為CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞。按試劑盒步驟對(duì)Th17和Treg細(xì)胞進(jìn)行熒光抗體染色，孵育完成后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比表示。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)絨毛和蛻膜中RORγt和Foxp3的mRNA水平 收集所有入選對(duì)象的絨毛和蛻膜，用PBS沖洗去除黏液和血液。無(wú)菌條件下剪碎組織，加入0.25%的胰酶-EDTA(pH8.0)于37 ℃消化1 h，參照TRIzol試劑盒說(shuō)明書方法抽提總RNA，并采用隨機(jī)引物和RNase H反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA，然后采用SYBR Premix Taq試劑盒在熒光定量PCR儀上完成擴(kuò)增檢測(cè)。引物序列為Foxp3，F(xiàn):5′-TCT TCC TTG AAC CCC ATG CC-3′，R:5′-AAA TGT GGC CTG TCC TGG AG-3′；RORγt，F(xiàn):5′-GAG CCA AGG CTC AGT CAT GAG AA-3′，R:5′-GTC CCT CTG CTT CTT GGA CAT-3′。以上所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置復(fù)孔檢測(cè)。mRNA定量采用相對(duì)Ct法[6]，看家基因GAPDH用作標(biāo)準(zhǔn)化，無(wú)模板標(biāo)本用作無(wú)模板對(duì)照，目的基因定量公式為2-ΔCt= Power(2,-(Ct目的基因-CtGAPDH))。

1.3.4 ELISA檢測(cè)外周血細(xì)胞因子水平 收集所有入選對(duì)象外周靜脈血，800×g離心10 min分離血清備用。采用商品化的ELISA試劑盒測(cè)定血清中IL-17A、IL-17F、 TGF-β和IL-10的水平。以上所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置復(fù)孔檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 RSA患者絨毛和蛻膜中Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量 RSA患者絨毛和蛻膜中Treg細(xì)胞數(shù)量均分別低于正常對(duì)照組(t=7.499,P<0.01;t=6.701,P<0.01)；RSA患者絨毛和蛻膜中Th17細(xì)胞數(shù)量均分別高于正常對(duì)照組(t=7.994,P<0.01;t=8.694,P<0.01)；RSA患者絨毛和蛻膜中Treg/Th17比值均分別低于正常對(duì)照組(t=10.030,P<0.01;t=11.122,P<0.01)，見表1。

表1 RSA患者和正常對(duì)照組絨毛和蛻膜中Treg和Th17細(xì)胞數(shù)量比較±s)

2.2 RSA患者絨毛和蛻膜中RORγt和Foxp3的mRNA水平 RSA患者絨毛和蛻膜中Foxp3表達(dá)均明顯低于正常對(duì)照組(t=14.132,P<0.01;t=14.411,P<0.01)，而RORγt表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組(t=14.132,P<0.01;t=12.377,P<0.01)。其中RSA患者絨毛中RORγt表達(dá)是正常對(duì)照組的2.5倍(5.7/2.3)，蛻膜中RORγt表達(dá)是正常對(duì)照組的3.0倍(17.1/5.7)；絨毛中Foxp3表達(dá)是正常對(duì)照組的0.2倍(2.1/10.5)，蛻膜中Foxp3表達(dá)是正常對(duì)照組的0.2倍(1.5/7.5)，見表2。

2.3 RSA患者外周血中Treg和Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平 RSA患者外周血中Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β和IL-10水平均明顯低于正常對(duì)照組(t=10.691,P<0.01;t=13.182,P<0.01)，而Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A和IL-17F水平均明顯高于正常對(duì)照組(t=12.030,P<0.01;t=11.601,P<0.01),見表3。

表2 RSA患者和正常對(duì)照組絨毛和蛻膜中RORγt和Foxp3的mRNA水平比較

表3 RSA患者和正常對(duì)照組外周血Treg和Th17相關(guān)細(xì)胞因子比較

2.4 RSA患者和正常對(duì)照組絨毛和蛻膜中Treg、Th17細(xì)胞數(shù)量與外周血相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系 RSA患者和正常對(duì)照組絨毛中Treg數(shù)量與外周血TGF-β、IL-10水平呈正相關(guān)(r=0.966,P<0.01;r=0.961,P<0.01)，蛻膜中Treg數(shù)量與外周血TGF-β、IL-10水平也呈正相關(guān)(r=0.955,P<0.01;r=0.952,P<0.01)；RSA患者和正常對(duì)照組絨毛中Th17數(shù)量與外周血IL-17A、IL-17F水平呈正相關(guān)(r=0.961,P<0.01;r=0.953,P<0.01)，蛻膜中Th17數(shù)量與外周血IL-17A、IL-17F水平也呈正相關(guān)(r=0.967,P<0.01;r=0.972,P<0.01)。

3 討 論

RSA是目前難治性不育中急需解決的問(wèn)題，一般認(rèn)為與染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖結(jié)構(gòu)畸形和感染有關(guān)；此外尚約有60%～70%患者原因不明，研究發(fā)現(xiàn)RSA患者體內(nèi)免疫失衡可能是重要原因之一。Treg和Th17細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的不同于Th1、Th2的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞亞群，Treg細(xì)胞是一種下調(diào)免疫應(yīng)答的細(xì)胞，表達(dá)Foxp3并通過(guò)接觸抑制或分泌IL-10和TGF-β等細(xì)胞因子發(fā)揮維持自身免疫耐受和抗炎的功能；Th17細(xì)胞表達(dá)RORγt，主要分泌IL-17A和IL-17F，可能在自身免疫性疾病、炎癥和腫瘤等多種免疫性疾病中起重要作用[2]。研究表明，Treg/Th17平衡失調(diào)與多種疾病有關(guān)[3]，而其與RSA的關(guān)系目前尚不清楚。

正常的母胎免疫耐受是成功的妊娠過(guò)程的有力保證，正常孕婦的母胎免疫耐受既能抵抗微生物感染又不排斥表達(dá)半同種異體父系抗原的胚胎或胎兒[7]。Treg細(xì)胞是一群獨(dú)特的CD4+T細(xì)胞亞群，具有免疫抑制功能，介導(dǎo)體內(nèi)的免疫抑制效應(yīng)，是維持免疫耐受和控制免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞。Treg細(xì)胞數(shù)量降低與機(jī)體受損的免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)[8]。正常妊娠的小鼠和人類Treg細(xì)胞數(shù)量明顯增多，在母體免疫細(xì)胞首次接觸胎兒抗原是起關(guān)鍵的保護(hù)作用。Treg細(xì)胞增殖不足的小鼠有流產(chǎn)傾向，而正常妊娠小鼠的Treg細(xì)胞的增殖能力較高；有流產(chǎn)傾向的小鼠經(jīng)過(guò)繼免疫來(lái)自正常妊娠小鼠的Treg細(xì)胞能夠阻止自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛和蛻膜中Treg細(xì)胞數(shù)量和Foxp3的mRNA水平均低于正常對(duì)照組，其外周血中TGF-β和 IL-10水平也均低于正常對(duì)照組；同時(shí)，RSA患者和正常對(duì)照組的絨毛和蛻膜中Treg細(xì)胞數(shù)量與外周血中TGF-β和 IL-10水平呈正比。活化的Treg細(xì)胞能分泌包括TGF-β和 IL-10等大量的免疫抑制因子，而TGF-β和 IL-10參與調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能，TGF-β是維持Treg細(xì)胞數(shù)量和功能的關(guān)鍵因子，IL-10能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生[10]。因此，本研究結(jié)果提示，RSA患者絨毛和蛻膜中Treg細(xì)胞數(shù)量減低和功能缺陷減弱了患者的免疫抑制功能，并與自發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。

Th17細(xì)胞是另一群不同于Th1、Th2和Treg細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞，分泌IL-17A、IL-17F、 IL-22和IL-26等細(xì)胞因子，原始CD4+T細(xì)胞在TGF-β、IL-6、IL-23和IL-1的作用下分化為Th17細(xì)胞[11]。Th17細(xì)胞可能在自身免疫性疾病、炎癥和腫瘤等多種免疫性疾病中起重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛和蛻膜中Th17細(xì)胞數(shù)量和RORγt的mRNA水平均高于正常對(duì)照組，其外周血中IL-17A和 IL-17F水平也均高于正常對(duì)照組；同時(shí)，RSA患者和正常對(duì)照組的絨毛和蛻膜中Th17細(xì)胞數(shù)量與外周血中IL-17A和 IL-17F水平呈正比。IL-17通過(guò)介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，激活I(lǐng)L-1、IL-6、IL-8、TNF-α、NO、基質(zhì)金屬蛋白酶、NF-κB配體的受體活化劑和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子而引發(fā)炎癥反應(yīng)[13]。因此，本研究結(jié)果提示，RSA患者絨毛和蛻膜中Th17細(xì)胞數(shù)量增多和過(guò)度的功能活化增強(qiáng)了患者的炎癥反應(yīng)，并與自發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生密切相關(guān)。

近年來(lái)Treg/Th17平衡與妊娠的關(guān)系受到廣泛重視，研究發(fā)現(xiàn)RSA患者外周血和蛻膜中Treg細(xì)胞明顯減少[14]，作者前期研究也證實(shí)RSA患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量低下且免疫下調(diào)性細(xì)胞因子TGF-β和IL-10水平降低[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者絨毛和蛻膜中Treg/Th17比值明顯低于正常對(duì)照組。Th17和Treg細(xì)胞來(lái)自同樣的前體細(xì)胞，原始CD4+T細(xì)胞在TGF-β和IL-6刺激下分化為Th17細(xì)胞而在TGF-β刺激下分化為Treg細(xì)胞；同時(shí)Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORγt能夠相互抑制對(duì)方的功能。因此，本研究結(jié)果提示，Treg/Th17平衡失調(diào)與自發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明絨毛和蛻膜中Treg/Th17數(shù)量和功能平衡在維持正常妊娠中發(fā)揮重要作用，絨毛和蛻膜中Treg/Th17數(shù)量和功能失衡可能參與RSA免疫發(fā)病機(jī)制。探討絨毛和蛻膜中Treg/Th17細(xì)胞數(shù)量和功能平衡與RSA發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，將可能為診斷和治療RSA的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Immune unbalance detection of Treg / Th17 in villus and deciduas in patients with habitual abortion and its clinical significance*

YANGXiao-meng1,ZHAODan2,DULi-wei1,TANGQiong-ling1,JIANGShu-ping1,CHENXiang1,CHENShu-en1,JIANGYan-hua3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,LuohuDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Shenzhen,Guangdong518019,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,LuohuDistrictChronicDiseasePreventionandCureHospital,Shenzhen,Guangdong518023,China; 3.DepartmentofGynaecologyandObstetrics,LuohuDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Shenzhen,Guangdong518019,China)

Objective To investigate the role of immune unbalance of Treg/Th17 in villus and decidua on the immunopathogenesis in recurrent spontaneous abortion(RSA).Methods The villus and decidua specimens were collected from the patients with RSA and early pregnancy women of voluntarily terminating pregnancy(normal control group).The Treg/Th17 cell count was detected by the flow cytometry.The RT-PCR method was adopted to detect the mRNA levels of RORγt and Foxp3 in villus and decidua.The levels of peripheral blood IL-17A,IL-17F,TGF-β and IL-10 in the two groups were detected by ELISA.Finally,the correlations between Treg cells with the related cytokines and between Th17 cells with the related cytokines were statistically analyzed.Results Compared with the normal control group,the Th17 cells in villus and decidua in the patients with RSA were significantly increased(P<0.01),while the Treg cells were significantly decreased(P<0.01),the mRNA level of RORγt was significantly increased(P<0.01) and the mRNA level of Foxp3 was significantly decreased(P<0.01); the peripheral blood IL-17A and IL-17F levels in the RSA patients were significantly increased(P<0.01) and the TGF-β and IL-10 levels were significantly decreased(P<0.01).The Treg cells quantity was positively correlated with the peripheral blood TGF-β and IL-10 levels and the Th17 cells quantity was positively correlated with peripheral blood IL-17A and IL-17F levels in the RSA patients and the normal control group(P<0.01).Conclusion The imbalance of Treg/Th17 in villus and decidua may be related with the immunopathogenesis of RSA.

Recurrent spontaneous abortion; Balance of Treg/Th17; TGF-β; IL-10; IL-17A; IL-17F

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(醫(yī)療衛(wèi)生類)(201203194)。

楊小猛，男，副主任技師，博士，主要從事分子免疫學(xué)和生殖免疫學(xué)基礎(chǔ)研究工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.009

A

1672-9455(2015)01-0022-04

2014-05-03

2014-09-21)