丙型肝炎病毒基因型與慢性丙型肝炎患者病情嚴重程度之間關系的研究*

喬 斌，汪 明，袁樂永，熊 格，李 艷(武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060)

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·論 著·

丙型肝炎病毒基因型與慢性丙型肝炎患者病情嚴重程度之間關系的研究*

喬 斌，汪 明，袁樂永，熊 格，李 艷△(武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060)

目的 分析丙型肝炎病毒(HCV)基因型與慢性丙型肝炎患者病情嚴重程度之間關系，為慢性丙型肝炎患者的臨床診斷和治療提供依據。方法 采用直接測序法對HCV進行基因分型，并測量患者未治療前HCV-RNA水平、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、清蛋白(ALB)、血紅蛋白(Hb)、血小板計數(PLT)水平。結果 共對321株HCV進行基因分型，其中1a型占1.2%，1b型占78.5%，2a型占8.7%，3a型占2.2%，3b型占4.7%，6a型占2.8%，6b型占1.9%。HCV1型患者ALT、HCV-RNA、AST/PLT比值指數(APRI)水平明顯高于非1型患者，差異有統計學意義(P值分別為0.009，<0.01，0.036)；而AST、ALB、Hb、PLT、AST/ALT水平兩者并無明顯差異。結論 HCV1型患者HCV-RNA水平高于非1型患者，肝臟功能損害較非1型患者嚴重。

丙型肝炎病毒； 基因型； 丙氨酸氨基轉移酶； 天門冬氨酸氨基轉移酶； 血小板計數

丙型肝炎是一種呈全球性分布的傳染性疾病，2012年WHO統計大約有1.5億人感染丙型肝炎病毒(HCV)，其中75%～85%發展為慢性感染，每年有超過35萬人死于HCV感染相關的肝臟疾病[1-2]。我國慢性丙型肝炎感染患者大約有(2 000～5 000)萬，約占世界所有丙型肝炎患者的15%～30%[3]。研究發現，不同基因型的HCV感染患者病情嚴重程度有所差異。本文對慢性丙型肝炎感染患者的病毒基因型及相關指標進行檢測分析，為慢性丙型肝炎患者的臨床診斷和治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選擇2011～2013年武漢大學人民醫院收治的321例慢性丙型肝炎初治患者，其中男180例，平均年齡(43.96±18.44)歲；女141例，平均年齡(50.77±12.20)歲。慢性丙型肝炎的診斷符合2004年《丙型肝炎防治指南》中的診斷標準[4]，所有納入患者入院之前均無系統的接受抗病毒治療，并且無其他疾病。

1.2 檢測方法

1.2.1 HCV基因分型檢測 HCV-RNA提取采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血漿TRIzol LS提取法，提取后的RNA使用Thermo公司的RevertAid?第一鏈cDNA Synthesis試劑盒進行反轉錄，反轉錄引物為隨機引物；測序引物forward primer 5′-TTA ACC ACA TCM RCT CCG TGT G-3′,reverse primer 5′-GTA CCT GGT CAT AGC YTC CGT RAA-3′，采用ABI公司3130XL測序儀檢測。測序結果與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)上的參考序列AF009606、AF271632和AF139594等進行比對分析，確定HCV基因型。

1.2.2 HCV-RNA定量檢測 HCV-RNA提取采用凱杰公司的QIAcube全自動核酸提取儀及配套試劑(凱杰careHCV RT-PCR Assay V1試劑盒)，使用羅氏LighterCycler480 PCR儀及凱杰careHCV RT-PCR Assay V2試劑盒進行HCV-RNA定量，線性范圍為1×103～5×107；定量結果超過線性范圍(>5×107)以5×107計算。

1.2.3 相關指標檢測 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、清蛋白(ALB)、血紅蛋白(Hb)、血小板計數(PLT)水平檢測通過檢驗科常規生化儀(Olympus AU-5400；Simens ADVIA2400)和血細胞儀(Sysmex XE-2100)測量。

2 結 果

2.1 共對321例丙型肝炎患者的HCV進行基因分型，其中1a型4例，占1.2%；1b型252例，占78.5%；2a型30例，占8.7%；3a型7例，占2.2%；3b型15例，占4.7%；6a型9例，占2.8%； 6b型6例，占1.9%。見圖1。

2.2 256例HCV基因型1型患者與65例基因型非1型患者相關指標的比較 兩者在AST、ALB、Hb、PLT水平上差異無統計學意義(P值分別為0.471、0.597、0.835、0.378)；在ALT、HCV-RNA、AST/PLT比值(APRI)水平差異有統計學意義(P值分別為0.009、<0.01、0.036)。見表1。

表1 HCV基因型1型與非1型相關指標的比較±s)

注：HCV-RNA定量結果以對數值計算log10(HCV-RNA)。APRI：AST/PLT比值。

圖1 HCV基因型分布

3 討 論

HCV基因組呈現高度異質性，根據HCV基因組序列的差異程度，目前可將HCV分為6個主要基因型(30%～35%)、68個基因亞型(20%～25%)及若干分離株(5%～8%)和準種(1%～5%)[5-6]。我國大部分地區主要流行的HCV基因為1b型，其次為2a型，南方城市1b基因型感染率可達到90%以上，從南向北2a基因型逐漸增多。目前為止，我國尚未發現HCV基因型4或5型感染[4]。本研究通過對321例慢性丙型肝炎HCV基因分型發現，1b型為主要感染基因型，占78.5%；其次為2a型，占8.7%；向下依次為3b型占4.7%，6a型占2.8%，3a型占2.2%，6b型占1.9%，1a型占1.2%。由于不同HCV基因型的核苷酸序列存在差異，因此HCV不同基因型在感染性、致病力、對抗病毒治療的反應性和地區群集等方面有著明顯的差異。本研究發現HCV 1型患者HCV-RNA水平明顯高于非1型患者(P<0.01)，而兩者的基礎狀態無明顯差別，ALB水平、Hb水平、PLT水平均無明顯差異。目前研究認為，HCV 1型病毒載量明顯高于非1型患者，這可能與HCV 1型具有更強的復制能力相關[7-8]。而病毒載量又與患者的抗病毒治療效果相關，低病毒載量常常更易獲得持續性病毒應答(SVR)[9]。

肝臟代謝酶水平是反映肝臟組織損害的最靈敏指標之一，其中ALT、AST是應用最多的兩個肝臟代謝酶，水平越高，肝臟組織損害程度越嚴重。本研究通過對HCV基因型1型和非1型患者血清ALT、AST水平進行比較分析，發現HCV基因型1型患者ALT水平明顯高于非1型患者，差異有統計學意義(P=0.009)，而AST、AST/ALT水平差異無統計學意義(P值分別為0.471、0.15)。這可能由于ALT存在胞質內，肝細胞受到破壞更易進入血循環中而檢測到，而AST位于線粒體內，需要進一步的破壞尚可釋放入血循環，并且慢性丙型肝炎患者肝臟損傷是慢性持續性的，這也可能導致ALT水平升高明顯，而AST水平升高不明顯。HCV基因型1型感染與肝炎的慢性化進程和嚴重的肝臟疾病有關，推測這與型特異性基因編碼的蛋白有較強的細胞毒作用有關。相關研究也表明，基因型1b在慢性肝炎、肝硬化和肝癌中占絕大多數，同時多表現為血清ALT升高，提示易導致肝細胞損傷[10-11]。

APRI作為一個簡單、非侵入性指標用來反映慢性丙型肝炎患者肝臟纖維化及肝硬化程度。研究發現，APRI>1.5，肝臟呈現嚴重的纖維化改變；APRI>2.0，肝臟呈現肝硬化改變[12]。本試驗對發現HCV基因型1型患者APRI水平高于非1型患者，也從側面反映出基因型1型患者肝臟損害程度更加嚴重。

另外，有研究表明，HCV基因型1a、2a合并HBV感染的發生率較高，大部分急性肝炎患者為基因型1a；基因型3a感染與肝臟脂肪變的關系較為密切；基因型4感染易引起失代償性肝臟并發癥[13]。因此，丙型肝炎防治指南中推薦對丙型肝炎患者治療前，應進行HCV基因分型，評估患者的病情，為患者制訂合適的治療方案，而且可以預測治療效果[14]。

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Relationship between HCV genotypes and severity degree of patients with hepatitis C*

QIAOBin,WANGMing,YUANLe-yong,XIONGGe,LIYan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To analyze the relationship between hepatitis C virus(HCV) genotypes and the severity degree of the patients with hepatitis C in order to provide the basis for the diagnosis and treatment of chronic hepatitis C(CHC).Methods The genotype of HCV was tested by the direct sequencing method,and the levels of HCV-RNA,ALT,AST,ALB,Hb,PLT,AST/ALT and AST to ptatelet ratio index(APRI) before treatment were determined.Results 321 strains of HCV were performed the genotyping,in which,1b,2a,3b,6a,3a,6b and 1a accounted for 78.5%,8.7%,4.7%,2.8%,2.2%,1.9% and 1.2% respectively.The levels of ALT,HCV-RNA,APRI in the patients with HCV genotype 1 were higher than those in the patients with non-genotype 1,the differences had statistical significance(P<0.01); while the levels of AST,ALB,Hb,PLT and AST/ALT had no statistical differences between the two groups.Conclusion The level of HCV-RNA in the patients with genotype 1 is higher than that with non-genotype1,and the liver damage is severer

HCV； genotype； ALT； AST； PLT

國家重點臨床專科建設項目(財社[2010]305號)。

喬斌，男，碩士，主要從事感染性疾病的分子診斷工作。△

，E-mail：liyan@whu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.01.002

A

1672-9455(2015)01-0004-02

2014-03-13

2014-08-01)