酶聯免疫吸附分析法測定豬、雞糞便中11種β-受體激動劑殘留

周悅榕，李丹妮，顧欣，嚴鳳，吳劍平，張鑫

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

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酶聯免疫吸附分析法測定豬、雞糞便中11種β-受體激動劑殘留

周悅榕，李丹妮，顧欣，嚴鳳，吳劍平，張鑫

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

以市售β2-受體激動劑酶聯免疫檢測試劑盒為基礎，建立了可同時測定豬、雞糞便中克侖特羅、溴布特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、卡布特羅、馬噴特羅、吡布特羅、西馬特羅、西布特羅、克侖潘特11種β2-受體激動劑的酶聯免疫吸附(ELISA)分析法。該方法對豬、雞糞便樣品的檢出限為5 ng/g，豬糞便樣品的添加回收率為57.3%～247.4%，雞糞便樣品的添加回收率為89.3%～177.3%，豬糞便樣品重復測定結果的相對標準偏差為0.3%～14.3%，雞糞便樣品重復測定結果的相對標準偏差為0.2%～23.5%。

β2-受體激動劑;多殘留;豬糞便;雞糞便;酶聯免疫吸附分析法

β2-受體激動劑屬苯乙胺類藥物。因其具有“脂肪再分配效應”，可顯著提高飼料轉化率與提高酮體瘦肉率而被非法用于畜牧生產[1-2]。人類經食物鏈攝入含藥物殘留的動物源性食品會引發肌肉震顫、心律失常、眩暈乏力等中毒癥狀危及人類健康[3]。我國相繼出臺了農業部176號公告[4]、193號公告[5]、235號公告[6]、1519號公告[7]等一系列法律法規，力爭從動物飲用水、飼料等源頭遏制其非法使用。

一直以來，動物肌肉、內臟、奶、蛋、尿液與血漿是獸藥殘留檢測中常見的樣品類型，但均存在采集工序繁瑣、采樣風險與成本高、樣品再利用率較低等問題。故近年來，探索新型活體檢材(如：毛發[8]、唾液[9]、視網膜[10])逐漸成為獸藥殘留分析研究的新方向。目前，已有從動物糞便中測定抗生素殘留的相關報道[11,12]，但尚沒有將其作為違禁物質殘留測定對象的相關報道。動物糞便是另一種重要的動物代謝產物載體，其采集方式更靈活便捷，可操作性強。據本實驗室前期研究表明部分藥物在豬糞便中代謝殘留量明顯高于豬尿中的殘留量。故糞便樣品可否作為獸藥殘留分析研究的新型活體檢材需進一步研究。

目前，有關動物源性食品中β2-受體激動劑類藥物分析方法的報道已有很多，主要有膠體金免疫層析法[13]、酶聯免疫吸附分析法[14-15]、氣相色譜-質譜法[16]、液相色譜法[17]、離子色譜[18]、毛細管電泳法[19]與液相色譜-串聯質譜法[20]等。其中酶聯免疫吸附分析法因其簡便、靈敏、快速、大通量等優勢被廣泛用于日常監測和篩查工作。但目前報道的β2-受體激動劑酶聯免疫檢測法大部分僅限于單個藥物。故建立一個便捷、快速、高效的β2-受體激動劑多殘留酶聯免疫檢測方法顯得尤為必要。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 BioTek ELX808酶標儀,帶450 nm波長濾光片，美國伯騰儀器公司，美國；BioTek Gen 5.0TM數據分析軟件,美國伯騰儀器公司，美國；PL202-L感量為0.01g電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，上海；AB135-S感量為0.00001g電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，上海；AllegraTMX-22R Centrifuge高速冷凍離心機,美國BECKMAN COULTER公司，美國；KS-260漩渦振蕩器,德國IKA公司，德國；MILLIPORE A10超純水系統,密理博(上海)貿易有限公司，上海；TARGIN VX-Ш多管渦旋振蕩器,北京踏棉科技有限公司，北京。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標準品 硫酸特布他林(Terbutaline Hemisulfate，純度≥ 100 %，批號：095K1629)購自sigma公司、鹽酸克侖特羅(Clenbuterol Hydrochloride，純度≥ 98.5 %，批號：20223)、沙丁胺醇(Salbutamol，純度≥ 99.00 %，批號：20618)均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司、溴布特羅(Brombuterol，純度≥ 100 %，批號：080415)、鹽酸馬布特羅(Mabuterol Hydrochloride，純度≥ 99 %，批號：120805)、醋酸卡布特羅(Carbuterol Acetate，純度98.5 %，批號：261533)、鹽酸馬噴特羅(Mapenterol Hydrochloride，純度≥ 99 %，批號：061005)、醋酸吡布特羅(Pirbuterol Acetate，純度99.9 %，批號：241741)、西馬特羅(Cimaterol，純度≥ 99 %，批號：071105)、西布特羅(Cimbuterol，純度≥100 %，批號：241418)、克侖潘特鹽酸鹽(Clenpenterol Hydrochloride，純度99.5 %，批號：241840)均購自witega公司。

1.2.2 試劑 β2-受體激動劑酶聯免疫試劑盒(批號：269534，英國朗道實驗診斷有限公司)；氫氧化鈉、鹽酸(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；甲醇 (色譜純，美國Merck公司)；實驗用水均為一級水。

1.2.3 標準貯備液的配制 分別精密稱取11種β2-受體激動劑標準品含藥物質量為0.01 g(精確至0.00001 g)，用適量甲醇溶解并定容10 mL，配制成含藥物濃度各為1 mg/mL的標準儲備液，置于4℃冷藏保存，有效期6個月。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理步驟 稱取豬、雞糞便樣品(2±0.01) g于50 mL離心管中，準確加入20 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液提取，充分混勻，振蕩10 min，離心5 min (9000 r/min)。取出全部提取液于另一支50 mL離心管中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節樣液的pH值范圍為7～9，離心5 min (9000 r/min)，取50 μL上清液供β2-受體激動劑的酶聯免疫試劑盒檢測。

1.3.2 試劑盒檢測步驟 參見英國朗道實驗診斷有限公司β2-受體激動劑酶聯免疫試劑盒產品說明書。

1.3.3 檢測限和定量限 將不同來源的豬、雞糞便空白樣品各20份，按照1.3.1和1.3.2確定的方法處理并測定，計算豬糞、雞糞空白樣品測定平均值，并對應加上3倍標準差即為β2-受體激動劑酶聯免疫分析篩選檢測方法的檢測限[21]。方法定量限的確定過程參照《關于發布<獸藥殘留酶聯免疫試劑(盒)備案審查技術資料要求>和<獸藥殘留酶聯免疫試劑(盒)參考評價標準>的通知》[21]的要求。

1.3.4 準確度和精密度 向豬、雞糞便空白樣品中分別準確加入一定質量濃度的11種β2-受體激動劑標準品，添加濃度為分別為定量限和2倍定量限[21]。添加樣品按照1.3.1和1.3.2確定的方法處理并測定，批內相同的質量濃度水平做5次平行實驗，重復3個批次，計算11種β2-受體激動劑的加標回收率(R / %)及批內、批間的相對標準偏差

(RSD/ %)。11種β2-受體激動劑的加標回收率應40%，批內相對標準偏差應30%，批間相對標準偏差應40%[21]。

2 結果

2.1 標準曲線 質量濃度為0.00、0.10、0.25、0.50、1.00、5.00 ng/mL的系列標準溶液，按1.3.2的試劑盒檢測步驟測定，使用BioTek Gen 5.0TM數據分析軟件采用4參數擬合方程，以克侖特羅標準品濃度的對數為橫坐標，以450 nm波長處的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線見圖1和表1，IC50數值為0.456 ng/mL。

圖1 豬、雞糞便的ELISA標準曲線

曲線名稱曲線公式ABCDR2IC50值/(ng·mL-1)標準曲線Y=(A-D)/(1+(X/C)^B)+D1.120.9060.4560.180.9970.456

2.2 50 %抑制濃度(IC50)范圍 重復測定20條標準曲線，統計IC50測定值，測定結果見表2。確定IC50的變化范圍為0.456 ～ 0.903 ng/mL。

表2 20條標準曲線IC50濃度統計表(單位：ng·mL-1)

2.3 交叉反應率 酶聯免疫吸附分析法的交叉反應實驗反映了該檢測方法在一個多元混合體系中檢測出目標化合物的能力，即抗體是否對特定分析物表現顯著的特異性，能夠區別干擾成分與特定分析物結構上的細微變化。通過比較待測物與其結構或功能類似物之間的測定交叉反應率考察檢測方法的特異性[22]。本試驗中11種β2-受體激動劑與克侖特羅抗體、沙丁胺醇抗體的交叉反應率參見英國朗道實驗診斷有限公司β2-受體激動劑酶聯免疫試劑盒產品說明書見表3。由產品說明書提供的結果得知試劑盒所用抗體與11種β2-受體激動劑均產生交叉反應，故該抗體可用于11種β2-受體激動劑的多殘留檢測。

表3 11種β2-受體激動劑與克侖特羅抗體、

2.4 檢測限和定量限 選擇豬、雞糞便空白樣品各20份考察檢測限見表4。并考察了以5 ng/g為豬糞便樣品中克侖特羅、溴布特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、卡布特羅、馬噴特羅、克侖潘特、西布特羅的定量限，以10 ng/g為豬糞便樣品中吡布特羅、西馬特羅的定量限。以5 ng/g為雞糞便樣品中克侖特羅、溴布特羅、沙丁胺醇、特布他林、馬布特羅、克侖潘特、西布特羅的定量限，以10 ng/g為雞糞便樣品中卡布特羅、馬噴特羅、吡布特羅、西馬特羅的定量限。結果表明，豬、雞糞便樣品的添加回收率均大于40%，滿足《關于發布<獸藥殘留酶聯免疫試劑(盒)備案審查技術資料要求>和<獸藥殘留酶聯免疫試劑(盒)參考評價標準>的通知》[21]的要求。

2.5 準確度和精密度 將11種β2-受體激動劑標準品分別以定量限和2倍定量限的添加濃度添加至豬、雞糞便空白樣品中，結果見表5。結果表明，豬糞便添加樣品回收率范圍在57.3%～247.4%之間，批內相對標準偏差(RSD/n=5)均在0.3%～14.3%之間，批間相對標準偏差(RSD/n=3)均在1.2%～17.4%之間，雞糞便添加樣品回收率范圍在89.3%～177.3% 之間，批內相對標準偏差(RSD/n=5)均在0.2%～23.5%之間，批間相對標準偏差(RSD/n=3)均在0.3%～20.5%之間。

表5 豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑批內、批間回收率及相對標準偏差

2.6 基質效應 準確稱取空白豬、雞糞便各(2 ± 0.01) g，按照1.3.1確定的樣品前處理方法處理，得到空白豬、雞糞便基質液。分別向其中加入適量的11種β2-受體激動劑，配制成含藥物濃度為4 ng/mL 的基質匹配標準溶液。同時，用0.1 mol/L鹽酸溶液(經1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7 ～ 9)稀釋標準品中間液配制成濃度相同的標準溶液。按照1.3.2確定的檢測步驟進行5次平行試驗，計算兩測定值之比(Matrix Effect/%)的平均值，以考察豬、雞糞便對11種β2-受體激動劑的基質效應，結果見表6。

2.7 實際樣品的測定 隨機抽樣上海市奉賢區、崇明縣不同養殖場的豬糞便樣品30份，雞糞便樣品44份，采用本實驗建立的酶聯免疫分析篩選檢測方法與液相色譜-串聯質譜法進行測定，每份樣品進行2次平行測定，結果取平均值。實際樣品經酶聯免疫分析篩選法測定后發現1份豬糞便樣品為陽性，檢測結果為6.53 ng/g，2份雞糞便樣品為陽性，檢測結果分別為6.03 ng/g和6.44 ng/g。所有實際樣品再經本實驗室開發的畜禽糞便中β2-受體激動劑的液相色譜-串聯質譜檢測法確證后表明，所有的實際樣品均為陰性。因此，該法檢測豬、雞糞便樣品中11種β2-受體激動劑的假陽性率分別為3.3 %和4.5 %。

表6 雞糞便和豬糞便對11種β2-受體激動劑的

3 討論與小結

3.1 樣品前處理步驟的確定 試驗充分考慮了β2-受體激動劑的化學性質，及對保護酶聯免疫試劑盒內包被的抗體的影響，考察了2種不同的樣品提取步驟(提取步驟Ⅰ：先加2 mL 1 moL/L鹽酸水溶液，后加18 mL水，充分混勻并振蕩；提取步驟Ⅱ：直接加20 mL 0.1 moL/L鹽酸水溶液，充分混勻并振蕩)的提取效果和3種不同的上樣pH值(pH值為7、8、9)對酶聯免疫法檢測的影響，以確定樣品前處理步驟。研究采用克侖特羅、沙丁胺醇、特布他林40.0 ng/g的雞糞便添加樣品，結果表明不同的提取方式和不同的上樣pH值對三種化合物提取回收率沒有顯著的影響，且回收率均能滿足檢測的要求。因此，考慮到簡化試驗步驟，兼顧提高試驗效能，選擇使用Ⅱ號提取步驟和范圍為7～9的上樣pH值。

3.2 基質效應 在儀器分析中經常需要復雜繁瑣的樣品前處理過程，基于抗體對分析物的選擇性，酶聯免疫分析方法通常不需要嚴格的提取和凈化過程。但是基質對酶聯免疫分析的干擾可能很大。大多數干擾會影響分析物與抗體的結合，或者改變酶標記物的活性，從而影響所建立的酶聯免疫方法的靈敏度和重現性[22]。結果表明，豬糞便基質中克侖特羅、沙丁胺醇、卡布特羅、西布特羅為基質減弱，其余化合物為基質增強。雞糞便基質中11種β2-受體激動劑均表現為基質增強。

研究在現有的市售β2-受體激動劑酶聯免疫檢測體系基礎上建立了一套簡便、快速且高效的豬、雞糞便中11種β2-受體激動劑多殘留的酶聯免疫吸附檢測方法，適用于對大量畜禽糞便樣品中β2-受體激動劑殘留的快速篩查。對于疑似陽性樣品需利用液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法或氣相色譜-質譜法等定量方法做進一步的確證。

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[21]中華人民共和國農業部農醫發[2005]17號. 關于發布《獸藥殘留酶聯免疫試劑(盒)備案審查技術資料要求》和《獸藥殘

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(編 輯：陳希)

Determination of 11 β2-Agonists Residue in Swine and Chicken Manure by Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ZHOU Yue-rong, LI Dan-ni, GU Xin, Yan Fen, WU Jian-ping, ZHANG Xin

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter,Shanghai201103,China)

A method for simultaneously detecting clenbuterol hydrochloride, brombuterol, salbutamol, terbutaline hemisulfate, mabuterol hydrochloride, carbuterol acetate, mapenterol hydrochloride, pirbuterol acetate, cimaterol, cimbuterol, clenpenterol hydrochloridein swine and chicken manure by ELISA was developed in accordance with commercial β2-Agonists-Testing ELISA kit.Furthermore, the limit of determination was 5 ng/g.The recoveries of the method in swine manure were from 57.3% to 247.4% withRSDranging from 0.3% to 14.3%, and the recoveries of the method in chicken manure were from 89.3% to 177.3% withRSDranging from 0.2% to 23.5%.

β2-agonists ;mulit- residues ; swine manure ; chicken manure ; ELISA

上海市市級農口系統青年人才成長計劃[滬農青字(2014)第2-2號]

周悅榕，助理畜牧師，從事獸藥殘留檢測與方法開發。E-mail:zhou_yuerong@qq.com

2015-05-18

A

1002-1280 (2015) 08-0039-07

S859.84