硫源對高溫厭氧產氫菌Caldicellulosiruptor changbaicum發酵產氫的影響

于雷等

摘要：以從長白山溫泉中篩選到的高溫厭氧產氫菌Caldicellulosiruptor changbaicum為菌種，研究硫源對其發酵纖維素產氫的影響。先以Na2S、Na2SO4、Na2SO3和Na2S2O3為硫源進行單因素試驗，考察硫源對菌株生長和產氫的影響。然后在生物反應器中分別以Na2S和Na2S、Na2S2O3混合物為硫源進行厭氧發酵試驗。結果在以Na2S ∶Na2S2O3=1 ∶2的混合物為產氫菌提供硫元素時，發酵液pH值呈穩定下降趨勢，產氣穩定時的平均速率為90～100 mL/（L·h），氫氣的轉化效率達到7.73 mmol/g VS，說明Na2S、Na2S2O3混合硫源有利于該高溫厭氧菌發酵纖維素產氫。

關鍵詞：高溫厭氧產氫菌；Caldicellulosiruptor changbaicum；纖維素；硫源；氫氣；生物反應器；發酵產氫

中圖分類號： TQ920.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0326-03

收稿日期：2014-03-20

基金項目：吉林省科技發展規劃項目（編號：20100563）。

作者簡介：于雷（1973—），男，吉林長春人，博士，副教授，研究方向為食品科學與發酵工程。E-mail：leiyujl@sina.com。進入21世紀以來，從石油、煤炭等礦產資源開采量的不斷上升以及儲存量的不斷減小，到人們對可替代能源的追求與探索，能源問題已經成為了全世界共同關注的焦點問題[1]。氫氣作為一種可燃的氣體，有著諸多方面的優點。例如環保，氫氣燃燒后的產物除了水之外沒有其他任何物質，是絕對無污染的；另外，氫氣的燃燒值最高，達到了3 042 cals/m3，且燃燒的熱轉化效率也很高。因此，關于制氫技術的研究成為了近年來人們關注的熱點[2]。

在所有的制氫技術中，生物制氫以其反應條件溫和、節能、可再生，還可以治理工業污染等諸多優點，逐漸成為了研究的熱門領域[3]。生物制氫主要分為兩大類，一類為光合微生物發酵；另一類為厭氧微生物發酵。其中，厭氧微生物發酵生物質制氫具有治理污染、環保和高產能等特點，有著非常廣闊的開發前景，越來越多的厭氧產氫菌已經被發現并應用到富含纖維素污染物的處理當中[4]。高溫厭氧微生物在所有發酵產氫的厭氧微生物中，由于其發酵環境的溫度較高，發酵過程中產生的氣體不需要再經過后繼操作就可以快速溢出，因此在一定程度上降低了生產成本。而且氫氣的快速溢出，也減小了氫氣對發酵過程的抑制作用，從另一角度提升了發酵制氫的速率[5]。相對于其他厭氧產氫菌，高溫菌更易得到高的產氫效率[6-7]，理論最大產氫量可以達到每消耗1 mol/L菌葡萄糖產4 mol/L H2[8]，因此利用高溫厭氧菌發酵產氫具有較大的生產潛力。

在利用高溫厭氧產氫菌制氫的過程，影響其生長和產氫的因素很多[9]，如培養溫度、培養基pH值、培養所利用碳源、氮源的種類和金屬離子的影響等等。除上述因素以外，硫源對該類細菌的生長和制氫有著非常大的影響，該類細菌的生理生化特性表明硫元素為新陳代謝過程中的電子受體，因此硫元素是該類細菌生長所必須的元素之一[10-11]。本試驗主要研究硫源對分離自長白山溫泉的高溫厭氧產氫菌Caldicellulosiruptor changbaicum的生長以及產氫的影響，從而為其發酵產氫的應用提供理論和技術依據。

1材料與方法

1.1菌種及來源

高溫厭氧產氫菌由吉林大學分子酶學教育部重點實驗室提供，通過16S rRNA全序列比對及系統發育學分析，發現這株菌屬于熱解纖維素果汁桿菌屬，命名為Caldicellulosiruptor changbaicum。

1.2培養基

傳代培養基：0.33 g NH4Cl，0.33 g KH2PO4，0.33 g KCl，0.33 g MgCl2·6H2O，0.20 g CaCl2，1.0 mL 金屬離子，10.0 mL 維生素，1.5 g NaHCO3，0.5 g Na2S·9H2O，0.5 g刃天青，0.5 g酵母粉，5.0 g濾紙，1 000 mL去離子水。滅菌條件：115 ℃，20 min。其中金屬離子、維生素、NaHCO3、Na2S·9H2O、刃天青和濾紙單獨滅菌，在傳代時再分別加入；濾紙用組織搗碎機搗碎后再滅菌后利用。

金屬離子的配制：10.00 mL HCl（25%），1.5 g FeCl2·4H2O，70.00 mg ZnCl2，10.00 mg MgCl2·4H2O，6.00 g H3BO3，190.00 mg CoCl2·6H2O，2.00 mg CuCl2·H2O，24 mg NiCl2·6H2O，36 g NaMoO4，990 mL 去離子水。

維生素的配制：2.00 mg 維生素H，2.00 mg維生素B9，10.00 mg維生素B6，5.00 mg維生素B1-HCl·2H2O，5.00 mg 維生素B2，5.00 mg煙酸，5.00 mg泛酸鹽，0.10 mg維生素B12，5.00 mg對氨基苯甲酸，5.00 mg ZnSO4，1 000.00 mL 去離子水。

發酵培養基：發酵培養基與傳代培養基除硫源不相同以外，其他成分均相同。

1.3硫源單因素試驗

利用250 mL的厭氧瓶進行培養，培養基的體積為 200 mL，接種量為3%，利用N2、CO2體積比為4 ∶1的混合氣來提供厭氧環境，（75±1） ℃、120 r/min振蕩培養。

試驗分別利用含相同硫元素濃度的Na2S、Na2SO4、Na2SO3和Na2S2O3來提供硫環境，并以不加任何硫元素的培養基為對照，來研究高溫厭氧菌的生長及產氫的現象。

1.4生物反應器發酵endprint

如圖1所示，利用2.0 L的生物反應器進行發酵產氫試驗，發酵培養基的體積為1.7 L，接種量為12%[12]，利用連接75 ℃循環水浴的皮管套控制發酵溫度，利用磁力攪拌器對發酵液進行攪拌，轉速為300 r/min；培養基的碳源為0.5%的濾紙。通過“1.3”的試驗結果可以得到發酵產氫最佳的硫化合物或者混合物，然后以它們為硫源進行發酵試驗，從而確定最佳的硫源。

1.5分析方法

發酵液中還原糖利用DNS法測定[13]；發酵產生的氣體（H2、CO2、CH4等）利用氣相色譜法測定[14]，具體條件：用的柱子為3 m Hayesep Q 色譜柱，并利用熱導檢測器。進樣針和柱子的溫度分別為110、130 ℃。

2結果與分析

2.1高溫厭氧菌對硫源的選擇性

在相同的試驗條件下分別利用不同硫源對高溫菌進行培養，結果如表1所示。

試驗結果表明，對于高溫厭氧產氫菌Cal. changbaicum來說，硫是該類細菌正常生長所必需的元素，在硫元素缺乏的條件下，細菌不能生長。由表1可見，Na2S和Na2S2O3是硫元素的最佳提供者，細菌長勢良好。因此，在后面的生物反應器發酵試驗中，就以這2種化合物為發酵培養基提供硫元素。

但是在利用Na2S2O3為單一的硫源、培養基排氧時間與添加其他硫元素的培養基相同時，培養基的顏色為紅色，說明培養基中含有氧氣，厭氧菌無法生長。如果繼續使用Na2S2O3為硫源，那么對培養基進行排氧處理的時間就要相應地加長，一般排氧時間會在1 h左右，因此從排氧時間角度考慮，單獨利用Na2S2O3硫源不十分理想。而當培養基中添加Na2S時，排氧的時間只需要5 min左右，可見Na2S可以起到快速去除培養基中痕氧的作用。因此，在下面的反應器發酵過程中，分別選擇Na2S和Na2S、Na2S2O3的混合物作為硫源進行對比發酵試驗。

2.2生物反應器發酵過程中硫源的選擇

2.2.1以Na2S為硫源發酵產氫以Na2S為唯一的硫源，利用0.5%濾紙為碳源進行發酵產氫試驗，發酵過程中產氣速率與發酵液pH值的變化如圖2所示。

由圖2可知，當以濾紙作碳源、Na2S為唯一的硫源時，厭氧菌一直沒有得到很好的發酵效果，產氣速率一直維持在 15 mL/（L·h） 左右，發酵產生的氣體總量只有1 200 mL左右。

在發酵的前3 h，有大量的氣體溢出，經測定其中大部分為H2S，進而使得培養基的硫元素大量溢出，致使硫元素缺失，從而導致該菌無法正常生長。

另外，大量的H2S溢出也導致了在發酵的起始階段發酵液的pH值由7.0左右快速升高到8.4。雖然之后發酵液的pH值有所下降，但也都在7.6以上，而該菌最適pH值在 6.5～7.5 之間，使得該菌在偏堿性的pH條件下不能夠快速生長并產氣。

目前國外高溫厭氧菌發酵產氫的研究中，培養基硫源大多是直接由Na2S來提供的，其他硫化合物基本上都沒有用到。筆者所在課題組在試驗過程中發現單獨使用Na2S作為培養基的硫源并沒有得到較好的產氫效果。

2.2.2以Na2S和Na2S2O3的混合物為硫源發酵產氫由“2.2.1”的試驗結果可知，硫環境對發酵產氫起著非常重要的作用，單獨使用Na2S提供硫環境時，并沒有得到比較好的試驗結果，因此將試驗改為以Na2S和Na2S2O3的混合物來提供硫環境。

Na2S和Na2S2O3的添加的方法為在對培養基進行排氧的同時緩慢添加Na2S，直到培養基的顏色變為無色后，培養基所必需的剩余的硫元素再由Na2S2O3提供，按照硫含量的比例得出Na2S ∶Na2S2O3為1 ∶2。

如圖3所示，在以Na2S和Na2S2O3的混合物為硫源后，雖然在發酵前的5 h仍然有大量的H2S溢出，發酵液的pH值也有所升高，但由于此次利用的硫源為Na2S和Na2S2O3的混合物，細菌表現出仍然可以正常生長并產氣，因此在發酵進行5 h后，產氣速率又開始緩慢上升，發酵15 h左右產氣速率開始逐漸趨向穩定，一直到33 h左右產氣速率仍一直維持在 90 mL/（L·h） 左右。

此次發酵共產生了3 253 mL的氣體，經測定，氫氣的含量在40%左右，由此發酵共產生了58 mmol H2；得到的氫氣的轉化率達到了7.73 mmol/g VS，與Carver等試驗中利用的高溫厭氧產氫菌的轉化率相當[15]，達到了較高的轉化率，從而表明高溫厭氧菌Cal. changbaicum具有廣闊的應用前景。可見，在利用Na2S和Na2S2O3混合物作為硫源時，既可以快速排除培養基中的氧氣，減小培養基中的痕氧對細菌生長產生的不利影響，同時還可以保證培養基中有效的硫環境，實現高溫厭氧產氫菌的正常生長和產氫。

3結論

試驗結果表明，在高溫厭氧菌Cal. changbaicum的生長環境中沒有硫元素的存在時，細菌無法正常生長，說明硫元素是此類細菌的生長過程中的必需元素之一。高溫厭氧菌對硫源存在著一定的選擇性，通過厭氧瓶培養得到生長和產氫的最佳硫源為Na2S和Na2S2O3 2種化合物。當以Na2S和Na2S2O3混合物作為硫源在生物反應器中發酵時，氫氣的轉化效率高達7.73 mmol/g VS，這說明混合的硫源對高溫厭氧產氫菌發酵纖維素產氫具有明顯影響，從而為該菌的進一步利用提供了良好的理論和技術依據。

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