鐵炮百合離體再生體系的建立

向地英　薛木易　鄒麗紅

摘要：以鐵炮百合無菌苗的葉片、鱗片為外植體，進行鐵炮百合再生體系的研究。結果表明：鱗片的誘導分化能力高于葉片，鱗片分化培養基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）的分化率高達90.98%。用葉片為外植體，不同部位對不定芽的誘導影響較大，以葉片中部分化能力最強，上部次之，下部最差。葉片分化培養基為MS+1.0 mg/L BA+0.2 mg/L NAA，分化率為85.36%。2，4-D濃度對愈傷組織的誘導影響顯著，愈傷誘導培養基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D為佳，愈傷率達80%以上。

關鍵詞：鐵炮百合；離體再生；鱗片

中圖分類號： S682.2+65.04+3；Q943.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0055-03

收稿日期：2014-10-13

基金項目：河北省保定市科技項目（編號：12ZF073）。

作者簡介：向地英（1978—），女，重慶云陽人，博士，講師，主要從事觀賞植物抗逆生理研究。E-mail：43823526@qq.com。鐵炮百合（Lilium longifllorum）原產于我國臺灣，是重要的切花材料，其花朵極香，含有芳香油，可作香料，具有極高的觀賞價值、經濟價值[1-2]。傳統雜交育種技術因周期長，短期內無法培育出新的品種以滿足需求。植物的轉基因育種技術通過抑制內源基因或導入外源基因而定向改造植物性狀，突破了物種間的界限，創造出新種質，大大縮短育種進程。高效離體再生是轉基因的基礎環節。近年來，很多學者選用珠芽、幼莖段、葉片、鱗片等不同外植體嘗試百合的組織培養[3-5]。關于鐵炮百合的高效再生報道較少。本試驗以鐵炮百合組培苗葉片為材料，對不同外植體、不同激素配比進行研究，選出誘導愈傷、分化不定芽能力高的培養基類型，建立鐵炮百合高效離體再生體系，旨在為鐵炮百合遺傳轉化體系的建立奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為鐵炮百合無菌苗。

1.2方法

1.2.1不定芽的增殖取長3～5 cm的不定芽接種于繼代培養基MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA中，附加蔗糖3%、瓊脂0.6%，pH值為5.8。培養條件為溫度（25±1） ℃，光照周期12 h/d，光照度2 000 lx（約1個月繼代1次）。

1.2.2再生苗小鱗片、葉片誘導分化培養基的預篩選取再生小植株小鱗莖上的外層鱗片及葉片，接種在不同濃度激素組合的分化培養基中，培養基為MS+6-BA（0、0.5、1.0） mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L、MS+6-BA（05、1.0） mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 6 g/L、MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L。培養條件為溫度（25±1） ℃，光照周期 12 h/d，光照度2 000 lx，30 d后統計愈傷分化情況。

1.2.3葉片不同部位的誘導能力切取葉片上、中、下3段，在相同培養基類型及相同環境條件下培養，培養基類型為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，黑暗條件下培養，定期觀察其生長情況。

1.2.4再生苗鱗片的分化能力將再生植株苗上的小鱗片放在MS+（0.5、1.0、2、5、10） mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L培養基內培養。培養條件為溫度 （25±1） ℃，光照周期12 h/d，光照度2 000 lx，定期觀察其生長情況。

1.2.5不同濃度2，4-D對葉片基部誘導分化能力的影響切取葉片的基部接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+（0.2、3.0） mg/L 2，4-D、MS+（0、1.0） mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D、MS+3.0 mg/L 2，4-D培養基內暗培養，定期觀察其生長情況。

2結果與分析

2.1鱗片、葉片誘導分化培養基預篩選

以分化率、誘導率、生長勢為指標篩選出適宜的培養基，比較鱗片與葉片的誘導分化能力。鱗片的誘導分化能力明顯高于葉片。鱗片以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基為佳，葉片以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養基為佳。

2.2葉片不同部位誘導分化能力比較

葉片在培養基上培養一段時間后，葉片邊緣出現少量愈傷組織，20 d后愈傷組織表面出現白色芽點，再經過一段時間，芽點處形成大小、長短不一的不定芽，不定芽均為白色（圖1）。葉片不同部位分化能力不同，葉片中部分化率最高，上部次之，下部分化率最低（表1）。MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA比MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養基對葉片誘導分化能力強。

2.3不同激素配比對鱗片分化的影響

以分化率、叢芽數及芽生長勢為指標， 調整6-BA、NAA

的比例，篩選出最適合誘導不定芽的培養基，鱗片在培養基上培養一段時間后，鱗片基部膨大，15 d后，可見嫩綠色的芽點，25 d后，芽點處形成大小、長短不一的不定芽或叢芽。50、10 mg/L 6-BA培養基中外植體變化緩慢，其中以10 mg/L 6-BA最慢，30 d后仍只見鱗片基部膨大，60 d后其芽分化量少且矮。綜合不定芽生長情況可知，0.5、1.0 mg/L 6-BA等2種培養基較適宜（表2、圖2）。

2.42，4-D濃度對葉片分化能力的影響

2，4-D既可以誘導植物體細胞胚的發生，也可以抑制體細胞胚的發育。本試驗中，在僅有2，4-D作為誘導分化激素的培養基中，誘導率都不高。培養75d后，除了2，4-D表160 d鐵炮百合不同部位葉片分化能力0.2 mg/L+6-BA 0 mg/L培養基上有分化外，其余4種培養基均不分化不定芽（表3）。培養10 d后，基部葉片略微膨大，20 d后其上出現少量的愈傷組織，愈傷組織數量逐漸增多，愈傷組織塊逐漸增大（圖3、圖4）。

2.5暗培養與光培養對葉片分化能力的影響

光培養、暗培養對鐵炮百合葉片的分化有明顯影響。在相同的培養基中，暗培養的不定芽分化率顯著高于光培養，且暗培養比光照條件下培養葉片分化叢芽數多，芽也更健壯。所以，暗環境比光照環境更有利于葉片分化不定芽。

3結論與討論

有研究表明，NAA 與 6-BA 組合對很多百合品種的不定芽誘導效果較好[6-7]。較高濃度的分裂素與較低的生長素可以促進不定芽的分化[8]。本試驗結果表明，低濃度6-BA下鱗片分化率顯著高于10 mg/L 6-BA 鱗片 的分化率，10 mg/L 6-BA培養基誘導的不定芽數少，誘導率低，且長勢較弱，可能是因為過高的6-BA 抑制了不定芽的分化。以往鐵炮百合組織培養中，多數學者采用鱗片作為外植體，但由于鱗莖長期生長在土壤中，導致病原菌多，以致外植體很難徹底消毒。以葉片或花部等組織作為外植體可以大大降低污染率。

驗結果還表明，葉片不同位置的再生率不同，中部分化不定芽的能力最強，達85.36%，這與王杰等的結論[9]類似。光照條件對外植體分化有很大影響。曹孜義等認為，有的材料適合暗培養，有的適合光培養，暗光更有利于愈傷組織的誘導形成[10]。王杰等認為，光培養對麝香百合胚性愈傷組織長勢、體積增長、增殖系數有顯著的促進作用。本試驗中，暗培養比光照條件更有利于鐵炮百合葉片誘導不定芽。2，4-D常用于誘導愈傷組織與促進其生長[11]。在2，4-D對葉片分化的誘導試驗中，2，4-D 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培養基中，愈傷組織誘導率達80%，遠高于其他濃度組合。本試驗利用2，4-D誘導的葉片形成愈傷組織，不能分化不定芽，可能由于2，4-D抑制體細胞胚的發育所致[12]。綜上所述，鐵炮百合鱗片的誘導分化能力高于葉片，鱗片分化培養基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為宜。葉片分化培養基以MS+1.0 mg/L BA+ 0.2 mg/L NAA為宜。葉片的不同部位對不定芽的誘導影響較大，以葉片中部分化能力最強，分化率為82.36%，上部次之，下部最差。2，4-D濃度對愈傷組織的誘導具有顯著影響，愈傷誘導培養基以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D 為佳，愈傷率達80%以上。

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