番茄黃化曲葉病毒Rep基因植物表達載體的構建及對番茄的遺傳轉化

裴華麗　劉永光　喬寧　李美芹　薛其勤　楊天慧

摘要：克隆番茄黃化曲葉病毒的復制酶基因（TYLCV-Rep），并構建其植物表達載體，通過農桿菌介導法轉入番茄子葉外植體。經過共培養、潮霉素篩選和分化再生，獲得21株潮霉素抗性植株。PCR檢測和Southern Blot檢測結果表明，有3株呈陽性檢測反應，說明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因組中，陽性率為14.3%。煙粉虱接種試驗結果表明，番茄轉基因植株較非轉基因植株對番茄黃化曲葉病毒的抗性明顯增強。

關鍵詞：復制酶基因；黃化曲葉病毒；番茄；遺傳轉化；表達載體

中圖分類號：S436.412.1+1 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0041-04

收稿日期：2014-03-19

基金項目：國家大宗蔬菜產業技術體系建設專項（編號：CARS-25）；山東省高等學校科技計劃 （編號：J07WG06、J09LC59、J10LC73、J12LE56）；濰坊科技學院校級課題（編號：W13K029、W13K033、W13K051）；山東半島藍色工程研究院科研計劃（編號：sdlgy2013y014）。

作者簡介：裴華麗（1978—），女，山東濰坊人，碩士，講師，主要從事蔬菜分子育種研究。E-mail：peihuali2@163.com。

通信作者：劉永光，碩士，講師，主要從事植物病理方面的研究。E-mail：ygliu425@163.com。番茄在中國各蔬菜產區均有大面積的種植，在我國蔬菜周年供應中占有非常重要的地位。隨著溫室大棚的推廣及蔬菜反季節栽培效益的提高，溫室番茄栽培面積連年增長，其病害的發生也呈現逐步加重的趨勢。近年來，在番茄主產區相繼發現的番茄黃化曲葉病毒，對番茄植株的生長、開花、坐果等方面均產生嚴重的危害，給當地的番茄生產帶來巨大的經濟損失[1-6]。番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus）[4-7]，是一類世界范圍內廣泛發生的單鏈環狀DNA病毒。自1986年首次將煙草花葉病毒（ TMV） 外殼蛋白（ coat protein，CP） 基因導入煙草培育出抗TMV植株以來，利用病毒本身的基因導入植物獲得抗病毒植株已成為抗病毒基因工程的重要手段。在番茄轉基因抗病毒育種中，主要利用病毒的外殼蛋白基因和復制相關蛋白（replication-associated protein，Rep）基因。

復制酶是指由病毒編碼的，能特異合成病毒正負鏈RNA的RNA聚合酶，其核心功能是合成全長的病毒基因組RNA。在病毒編碼的復制酶組分中存在多個保守序列，這些序列對聚合酶的活性必不可少[8]。自1990年Golemboski等將TMV U1株編碼的復制酶的一部分基因序列轉入煙草中，得到了高抗的煙草植株[9]以來，人們已對許多病毒的復制酶基因介導的抗病性及其抗性機制開展了深入研究[10-13]。但利用轉番茄黃化曲葉病毒的復制酶基因來獲得番茄抗黃化曲葉病毒的實例還未見報道。本研究從番茄黃化曲葉病毒株中克隆黃化曲葉病毒的復制酶基因，并將其轉入番茄中以期獲得抗番茄黃化曲葉病毒植株，從根本上解決當前番茄普遍存在的病害問題，盡快培育出適合山東乃至國內主要番茄種植區的抗番茄黃化曲葉病毒株系，以滿足目前番茄產業的需求。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1植物材料植物受體番茄品種菜都六號購于山東省壽光市金田種苗有限公司。TYLCV病毒樣品采自山東省壽光市，番茄植株上部卷曲黃化及矮縮等具有感染番茄黃花曲葉病毒典型癥狀的葉片。

1.1.2菌株與試劑限制性內切酶BglⅡ、Eco 911、T4-DNA連接酶、DNA Marker均購自MBI公司，Taq DNA聚合酶、堿性磷酸酶購自寶生物工程有限公司，植物基因組DNA提取試劑盒、凝膠快速純化試劑盒、質粒小量提取試劑盒等均購自北京全式金公司。植物表達載體pCAMBIA1304、農桿菌LBA4404由山東農業大學竺曉平老師惠贈。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21由筆者所在實驗室保存。瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、頭孢霉素（Cef）、潮霉素（Hyg）、乙酰丁香酮（AS）、利福平（Rif）、鏈霉素（Str）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、3-吲哚乙酸（IAA）均購自Sigma公司，其他試劑為國產分析純。引物均由北京華大基因科技有限公司合成，其序列如表1所示。

1.1.3培養基基本培養基為MS培養基，各培養基附加蔗糖30 g/L、瓊脂7.5 g/L，pH值調至5.8。種子發芽的培養基為1/2MS；預培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；共培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 005 mg/L；選擇培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 400 mg/L；生根培基為1/2MS+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+ Cb 200 mg/L。

1.2試驗方法

1.2.1TYLCV-Rep基因的克隆用植物基因組DNA提取表1供試引物的序列情況

試劑盒提取番茄病葉總DNA，根據GenBank中雙生病毒序列設計引物Rep-F和Rep-R，以提取的番茄病葉總DNA為模板，進行PCR擴增，反應體系如下：2×Taq MasterMix 125 μL，Rep-F（10 pmol/L）1.0 μL，Rep-R（10 pmol/L）1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加ddH2O至終體積25.0 μL。反應條件為：94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃繼續延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2TYLCV-Rep基因片段的回收及克隆載體的連接、轉化用凝膠快速純化試劑盒對符合預期大小的片段進行回收、純化。采用凍融法將連接產物轉入Trans1-T1感受態細胞中，將菌液涂布于LB+Tet 100 mg/L+Amp 50 mg/L的平板上，室溫放置1 h，待菌液完全被吸收后，倒置平板放于 37 ℃ 培養過夜。

1.2.3轉化子的鑒定從轉化平板上挑取白色菌斑，用含有50 mg/L氨芐青霉素的液體培養基于37 ℃振蕩培養箱中培養6 h，用質粒小量提取試劑盒提取質粒，用引物Rep-F、Rep-R 進行PCR檢測，限制性內切酶BglⅡ和SpeⅠ進行雙酶切鑒定陽性克隆的正確性，將含有的重組質粒陽性克隆命名為pT-Rep-1，并送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4植物表達載體的構建按照圖1所示基因圖譜構建植物表達載體。用BglⅡ和SpeⅠ將TYLCV-Rep基因從克隆載體pT-Rep-1上切下，然后與同樣雙酶切的植物表達載體pCAMBIA1304連接后，轉化至大腸桿菌中，在含有50 mg/L Kan抗性的平板上進行培養。挑取陽性克隆進行PCR及BglⅡ、SpeⅠ雙酶切鑒定。將連接正確的重組質粒命名為1304-Rep，并送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.5番茄外植體材料的獲得選取飽滿、大小一致、新鮮的番茄種子用清水反復沖洗數次，先后用75%乙醇對番茄種子消毒30 s、20%次氯酸鈉消毒10 min，無菌水沖洗4～5遍，無菌濾紙吸干后，接種于種子發芽培養基中。暗培養至大多數種子發芽露白后，將其放到光照16 h/d、光照強度 1 600～1 800 lx、溫度（24±2） ℃的條件下培養1周后，取番茄無菌苗的子葉，切去葉尖、葉柄，其余部分切成0.5 cm×05 cm大小的葉塊，子葉正面向上接種至誘導愈傷的培養基上進行預培養。

1.2.6農桿菌介導Rep基因轉化番茄采用凍融法將重組質粒1304-Rep轉入農桿菌（LBA4404）中，于YEB+Rif 30 mg/L+Str 30 mg/L+Kan 50 mg/L平板上28 ℃培養 48 h。挑取含有重組質粒1304-Rep轉入農桿菌（LBA4404）單菌落，接種到加Str和Kan的10 mL液體YEB中，28 ℃、200 r/min 振蕩培養過夜，以1 ∶40加入到新鮮的無任何抗生素的YEB培養基中，于28 ℃恒溫搖床振蕩培養3～4 h，取液體MS培養基稀釋20倍后用于侵染。收集預培養基上的子葉放在培養皿中，倒入稀釋好的菌液，輕輕搖勻使外植體和菌液充分接觸，侵染10 min后，取出子葉，置于無菌濾紙上吸去多余菌液，接種到共培養基上28 ℃暗培養3 d。經共培養的外植體，轉入抑菌培養基上培養7 d后轉接于篩選培養基中，每2周更換新鮮培養基，并逐漸降低Carb濃度至200 mg/L。經篩選再生的抗性芽長至1.5～2 cm時，將其切下并剔凈基部附著的愈傷組織，接種到生根培養基上進行生根培養，待幼苗生長至3～4張真葉時，進行煉苗，移栽至營養缽中。

1.2.7潮霉素篩選濃度試驗在篩選培養基中分別添加0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mg/L Hyg，每個濃度篩選培養基接種10～15個外植體；在（25±2） ℃、光照約16 h/d、光照強度3 000 lx條件下培養，20 d后觀察生長情況。

統計愈傷組織誘導率和不定芽分化率。

1.2.8番茄抗性植株的檢測

1.2.8.1抗性植株的PCR檢測再生番茄植株的基因組DNA采用SDS法微量提取[14]。以質粒1304-Rep作陽性對照，以未轉基因的番茄基因組DNA為陰性對照，利用引物Rep-1304-F和Rep-1304-R進行PCR擴增，擴增條件同“1.2.3”節，PCR產物經10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.8.2抗性植株的Southern Blot檢測對以上擴增的PCR產物進行Southern Blot檢測，用生物素地高辛標記的Rep基因雜交探針、Southern轉膜、預雜交、雜交、洗膜、檢測等方法均按Roche 公司“DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I”中的說明進行。

1.2.8.3轉基因番茄T1代植株的PCR檢測待轉基因番茄T1代植株長至2葉1心時，采取尚未脫落的子葉提取基因組DNA。利用TYLCV-Rep基因上對應的特異引物進行目的基因的PCR擴增，擴增條件同“1.2.3”節，PCR產物經 10 mg/mL 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.8.4轉基因番茄T1代植株的抗病性鑒定2013年3月在濰坊科技學院蔬菜育種基地將轉基因T1番茄種子及同品種的非轉基因番茄種子播種于托盤中，當待測番茄植株長到3～4張真葉時，分別移栽于溫室大棚及繁殖保存煙粉虱的防蟲溫室，每個番茄材料設計3個重復，每個重復10株，植株隨機排列，常規管理，分別于移栽后7、14、21、42 d觀察葉片感病情況。

對病情調查及抗性評價時，由病級計算病情指數（DI）。根據Hanson等的分級方法[15-16]進行病級分級。本研究以42 d 時調查的病情指數為鑒定依據。

病情指數（DI）=[（各級發病株數×病級數）/（最高發病級數×調查株數）]×100。

按病情指數（DI）分別劃分為免疫，不侵染，DI=0；高抗（HR），0

2結果與分析

2.1TYLCV-Rep基因的PCR擴增

以F-Rep和R-Rep為引物，番茄病葉總DNA為模板進行PCR擴增，得到約1 200 bp的特異性擴增帶，與預期結果一致（圖2）。以經過PCR檢測的重組質粒為模板，用Rep-1304-F和Rep-1304-R為引物進行PCR擴增，均得到約 1 100 bp 的片段。

2.2基因序列測定及分析

將所得DNA序列輸入GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行Blast檢索，選擇并下載相應序列，采用DNASTAR、DNAMAN和MEGA 3.1軟件對所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄的相應基因的核苷酸序列進行比較和分析。結果證明，番茄黃化曲葉病毒復制酶基因核苷酸序列 1 074 bp，編碼357個氨基酸，與GenBank中相應的復制酶基因序列一致。

2.3植物表達載體的構建及其轉化

將構建好的1304-Rep轉化至農桿菌，提取重組質粒DNA，并以此為模板進行PCR擴增，分別得到約1 100 bp特異性擴增帶（圖3），片段大小與預期結果一致；經SpeⅠ和BglⅡ進行雙酶切均得到1條約1 100 bp的條帶（圖4），測序結果表明，1 074 bp的不含終止密碼的TYLCV的Rep基因序列已正向插入pCAMBIA1304載體中，沒有發生移碼，堿基沒有改變，與GenBank中報道的序列完全一致。

2.4潮霉素濃度篩選試驗

如圖5所示，番茄子葉對潮霉素較敏感，當潮霉素濃度為10 mg/L時，盡管仍然存在子葉增厚的現象，但愈傷組織誘導率急劇下降。當潮霉素濃度為12.5 mg/L時，只有少數子葉加厚，極少誘導出愈傷組織。當潮霉素篩選濃度達到 15 mg/L 時，無外植體愈傷組織長出，也無外植體膨大、加厚，外植體在4～6 d內相繼黃化死亡。為了抑制殺死非轉化細胞，同時又保證轉化細胞能正常生長，所以選擇潮霉素濃度為12.5 mg/L作為番茄轉基因材料的篩選濃度。

2.5番茄抗性植株的檢測

2.5.1番茄抗性植株的PCR檢測將潮霉素篩選呈陽性的21株番茄植株組培苗移栽到營養缽中，提取21株（TYLCV-Rep）潮霉素抗性番茄植株葉片及陰性對照的DNA，以相應質粒DNA為陽性對照，進行PCR擴增，擴增產物用10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖6）。結果發現，21株抗性植株中，有3株能擴增出與質粒DNA大小一致的1 200 bp左右的條帶，而陰性對照和另外18株均未擴增出任何條帶，說明TYLCV-Rep基因已整合到番茄基因組中，陽性率為14.3%。

2.5.2轉基因番茄植株的Southern Blot 檢測選取PCR反應呈陽性的轉基因番茄植株和非轉基因番茄植株葉片的總DNA，以非轉基因番茄植株葉片總DNA為陰性對照，以質粒酶切產物為陽性對照，分別經SpeⅠ和BglⅡ進行雙酶切后的酶切產物進行Southern Blot雜交。結果表明，質粒及轉基因番茄植株出現了相應的雜交信號，而未轉基因番茄植株則沒有相應的雜交信號（圖7）。說明TYLCV-Rep基因都已經整合進番茄的基因組中。

2.5.3轉基因番茄T1代的PCR檢測轉基因番茄T1代植株長至2葉1心時，采取尚未脫落的子葉提取基因組DNA。利用TYLCV-Rep基因上對應的特異引物進行目的基因的PCR擴增，擴增片段長度分約為1 200 bp，部分樣品的電泳結果見圖8。轉基因番茄T1代植株分別檢測到45個陽性植株，顯示TYLCV-Rep基因可以在后代中穩定遺傳。

2.5.4轉基因番茄T1代的抗病性鑒定利用煙粉虱對轉基因番茄進行侵染試驗。用PCR反應為陽性的轉TYLCV-Rep基因的番茄抗性植株做侵染試驗，以非轉基因植株作對照，防蟲溫室中植株表現如表2所示，非轉基因植株對TYLCV表現高感（HS），而轉基因植株對TYLCV表現出抗性（R）。田間抗病性觀察發現，侵染7 d后轉基因及非轉基因植株葉片均未發現有異常變化；14 d后發現非轉基因番茄植株葉片出現輕微黃化，轉基因植株葉片未發現有異常變化；21 d后非轉基因番茄植株葉片表現出典型的黃化卷曲癥狀，轉基因植株葉片未發現有異常變化；42 d后非轉基因番茄植株葉片表現出典型的嚴重黃化卷曲癥狀，轉基因植株葉片未發現有異常變化（圖9）。表明轉基因番茄植株的抗病性較非轉基因植株明顯增強。

表2番茄黃化曲葉病毒病抗性鑒定結果

品種侵染接種鑒定病情指數抗級田間鑒定抗級轉基因番茄6.8RR非轉基因番茄52.3HSHS

3結論與討論

與傳統育種方式相比，通過轉基因手段獲得抗性更具優越性，轉基因操作將有效單基因轉入優良的栽培品種中，避免了常規雜交育種中，受多基因控制及數量性狀遺傳等復雜性，從而使植株有效獲得相應的抗性。本研究TYLCV-Rep的全長序列通過構建相應的植物表達載體將其轉入番茄中，獲得了抗病性明顯增強的轉基因株系，該結果與Carr等的研究結果[17-18]一致。

在植物對病毒產生抗性的過程中可能涉及到一系列基因的表達，有些膜上基因的優先表達在植物的防御機制中起非常重要的作用。Carr等認為，轉基因植物表達的復制酶在病毒的侵染過程中作為一種調節蛋白發揮功能，打破了病毒正鏈和負鏈復制的平衡[19]；而Baulcombe則認為，復制酶基因是在RNA水平上介導對病毒的抗性[20]。利用這些與抗性表達有關的關鍵基因通過生物工程手段來提高番茄抗性的調控機理，仍需進一步研究；另外，對獲得相應抗性的番茄在某些條件下（如高溫）會部分喪失抗性的原因，也將是番茄抗病育種的研究內容之一。

本研究成功克隆了番茄黃化曲葉病毒的復制酶基因，通過基因工程手段，將抗病基因導入番茄基因組，獲得了抗病性增強的轉基因番茄植株，通過PCR、Southern-blot檢測表明該復制酶基因已成功轉入番茄基因組中，煙粉虱侵染的抗性鑒定結果表明轉基因番茄對TYLCV的抗性明顯增強。本研究為培育番茄抗黃化曲葉病毒的抗病品種提供了可靠的理論依據和相應的技術保障。

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