小擬南芥HDG12基因的克隆、生物信息學分析及植物表達載體的構建及植物表達載體的構建

梁志強　孔德真　李輝玲　裴娟　祝建波　王愛英

摘要：以小擬南芥基因組DNA為模板，運用同源克隆法獲得小擬南芥HDG12基因，命名為ApHDG12。運用生物信息學方法，對ApHDG12基因的理化性質(zhì)、保守序列、二級結(jié)構、亞細胞定位等進行了分析，并進行同源建模。經(jīng)測序和生物信息學軟件預測分析，結(jié)果顯示，ApHDG12基因由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成，mRNA長度為2 064 bp，編碼687個氨基酸，亞細胞定位于細胞核。系統(tǒng)進化樹顯示ApHDG12與Capsella rubella遺傳距離最近，CDD保守序列分析結(jié)果顯示ApHDG12有18～79位的同源異型域和206～436位的START結(jié)構域，屬于HD-zipⅣ類基因家族，同時構建了植物表達載體pBI121：：HDG12，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，為進一步研究基因功能奠定基礎。

關鍵詞：小擬南芥；HDG12基因；克隆；生物信息學

中圖分類號： Q78文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0033-05

收稿日期：2014-03-19

基金項目：石河子大學“自然科學與技術創(chuàng)新”團隊項目（編號：2011ZRKXTD-0605）。

作者簡介：梁志強（1988—），男，甘肅武威人，碩士，主要從事植物基因工程研究。E-mail：514326242@qq.com。

通信作者：王愛英，副研究員，主要從事植物基因工程與轉(zhuǎn)基因生物安全性評價研究。E-mail：way-sh@126.com。全球正面臨著水資源日益短缺的境況，由干旱造成的農(nóng)作物減產(chǎn)及經(jīng)濟損失逐漸加劇，因此甄別利用具有耐旱性的基因，提高作物的耐旱性，發(fā)展生物節(jié)水農(nóng)業(yè)，對于緩解水資源危機，保障國家的糧食安全、生態(tài)安全和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

擬南芥HD-zipⅣ類基因家族有16個成員，其中大部分在植物表皮層中表達，控制表皮細胞的分化、色素的合成、表皮毛和根毛的發(fā)育[1-2]。GL2在表皮毛部位表達，控制種皮、根毛以及莖葉表皮毛的發(fā)育[3]；ATML1和PDF2共同調(diào)節(jié)表皮的發(fā)育，若PDF2過量表達則影響花的形態(tài)以及開花時間[4]；ANTHOCYANINLESS2（ANL2）控制表皮層花青素的積累[5]；HDG11基因過量表達則會抑制表皮毛的分叉，且HDG11和HDG12基因共突變時這種現(xiàn)象更為明顯[1]，HDG11基因的過表達能夠提高植物的耐旱性[6]。前人針對HD-zip基因家族的研究結(jié)果表明，該家族內(nèi)成員的功能較為復雜，在植物生長發(fā)育的過程中均發(fā)揮著重要作用，因此更深層次的研究其基因家族內(nèi)成員的功能并加以合理利用具有十分重要的意義。

近年來，對擬南芥近緣種的研究已成為一個熱點，而新疆是擬南芥近緣種的分布中心[7]，小擬南芥（Arabidopsis pumila）是雙子葉模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的近緣種，為十字花科擬南芥屬的短命植物，在適應新疆特殊干旱氣候方面，小擬南芥表現(xiàn)出更為優(yōu)異的適應特性[8-9]。目前從小擬南芥中克隆得到了一些抗逆基因，與擬南芥有較高的同源性，如黃先忠等利用同源克隆法克隆的ApCBF1和AtCBF1編碼的氨基酸序列一致[10]；院海英等利用同源克隆法得到的ApNHX1與AtNHX1編碼的氨基酸序列比對結(jié)果為99%[9]；劉瑞娜等利用同源克隆法以AtHRD基因序列為模板設計同源引物克隆得到了小擬南芥ApHRD[11]。本研究以小擬南芥基因組DNA為模板，根據(jù)NCBI上HDG12基因序列設計同源引物，克隆得到了ApHDG12基因，并利用生物信息學軟件及在線序列分析工具，對其進行結(jié)構與功能預測，以期為后續(xù)開展的ApHDG12基因功能和作用機理研究提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

小擬南芥種子由本實驗室保存，種植于“營養(yǎng)土 ∶蛭石=1 ∶2”的培養(yǎng)土中，置于20 ℃、16 h光照、8 h黑暗條件下培養(yǎng)。大腸桿菌TOP10、農(nóng)桿菌GV3101，Taq DNA聚合酶購自天根公司，PMD18-T simple vector kit、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1小擬南芥基因組DNA的提取采用CTAB優(yōu)化法[12]提取小擬南芥基因組DNA。

1.2.2小擬南芥ApHDG12克隆及測序根據(jù)NCBI上已提交的擬南芥HDG12基因（NM_101655.2）cDNA序列，運用Primer 5.0設計同源引物（F：5′-AGTTGTGTGATGGTCCAGAGTTAGC-3′，R：5′-GATTTCTTACACTCTTTGCAGGCAT-3′），以小擬南芥基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系參考Taq DNA Polymerase說明書。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58.0 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸3 min 10 s，30個循環(huán)，72 ℃總延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，與PMD18-T simple vector于16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素（50 μg/mL）、X-gal（20 mg/mL）、IPTG（200 mg/mL）的LB平板上進行藍白斑篩選，對重組克隆進行PCR鑒定。陽性克隆交由北京華大基因公司進行測序。

1.2.3序列分析測序結(jié)果用DNAMAN 6.0進行拼接，用FGENESH（http：//linux1.sof tberry.com/berry.phtml）進行分析并預測蛋白的氨基酸序列，蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預測用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，蛋白質(zhì)親疏水性預測用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析，蛋白亞細胞定位預測分別采用WolfPsort（http：//wolfpsort.org/）[13]、BaCelLO（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello）、Cello（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）3種工具分析。

通過NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/Str ucture/cdd/cddsrv.cgi）對ApHDG12蛋白序列的保守結(jié)構進行分析。運用NCBI的BlastP搜索與HDG12蛋白同源的其他植物序列，DNAMAN分析其相似性，使用MEGA5.2軟件Neighbor-Joining方法構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap分析次數(shù)為1 000次[14]。

利用在線工具HNN （http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa _gor4.ht ml）對ApHDG12蛋白二級結(jié)構預測，螺旋卷曲（coiled-coil）預測用COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html）分析。選擇同源建模SWISS-MODEL CPHMODELS對ApHDG12蛋白構建三級結(jié)構模型[15]。

1.2.4植物表達載體構建測序正確的PMD18-T：：HDG12用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切得到的目的基因片段，同時用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pBI121質(zhì)粒，切除GUS基因片段，回收表達載體大片段。將載體、片斷按1 ∶1比例，經(jīng)T4連接酶4 ℃過夜連接，產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細胞。挑取菌斑在含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，于 37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)5～6 h，進行PCR檢測，對陽性克隆提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定。BamHⅠ/SacⅠ酶切鑒定后得重組的植物表達載體命名為pBI121：：HDG12。

將酶切正確的質(zhì)粒，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取單克隆進行PCR鑒定，保存鑒定正確的單克隆菌液。

2結(jié)果與分析

2.1小擬南芥HDG12基因的克隆和測序

經(jīng)PCR擴增，電泳檢測得到3 000 bp左右的條帶（圖1），挑選其中2個單克隆進行測序，小擬南芥HDG12基因2條測序序列重復率為99.67%，與擬南芥HDG12基因比對，重復率為94.37%。測序分析PCR產(chǎn)物長度為3 034 bp，與預期結(jié)果相一致，命名為ApHDG12。

使用在線工具FGENESH對克隆到的ApHDG12基因組序列進行分析，得出ApHDG12基因包含10個外顯子、9個內(nèi)含子（圖2），并預測ApHDG12基因mRNA的長度為2 064 bp，編碼687個氨基酸。

氨基酸序列比對結(jié)果（圖3）顯示，ApHDG12與AtHDG12氨基酸序列相似性為93.18%。共計45位氨基酸發(fā)生了變異。這些發(fā)生變異的氨基酸位點是否是小擬南芥特有，有待于進一步驗證。在幾個擬南芥近緣物種中的Homeodomain結(jié)構域中，ApHDG12第5位氨基酸突變?yōu)榫彼酭，在擬南芥及其近源物種中HDG12第5位為賴氨酸K，表明該結(jié)構域第5位的R是小擬南芥特有位點，預示著這一位的氨基酸在同源異型域中起著重要的作用。

2.2HDG12蛋白保守序列預測

使用NCBI 的 CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫對FGENESH預測的ApHDG12氨基酸序列保守結(jié)構域進行分析，結(jié)果顯示，該序列具有典型的HD-zip轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構特點（圖4），氨基酸序列18～79位是同源異型域（Homeodomain）；206～436位是START結(jié)構域（START domain）。

2.3蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析和亞細胞定位預測

使用Portparam分析小擬南芥ApHDG12基因編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該序列的分子量為76 426.8 u，理論等電點為6.43，總負電荷殘基數(shù)目為74，總正電荷殘基數(shù)目為69，分子式為C3330H5304N950O1033S39，不穩(wěn)定指數(shù)為5252，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為81.32。

3種在線工具對ApHDG12亞細胞定位進行預測。WolfPsort預測結(jié)果顯示該蛋白定位于細胞核，Cello結(jié)果預測該蛋白定位于細胞核，可靠指數(shù)為2.694，BaCelLO預測結(jié)果該蛋白定位于細胞核，定位順序為：細胞內(nèi)>細胞核或細胞質(zhì)>細胞核。

2.4ApHDG12蛋白疏水性分析

用在線工具PortScale對小擬南芥ApHDG12基因編碼的氨基酸序列進行疏水性分析，窗口大小選擇9（圖5），結(jié)果表明，20位賴氨酸疏水性最弱，疏水指數(shù)為-3.944；341/342位半胱氨酸C/谷氨酸E 疏水性最強，疏水指數(shù)為1.956，多肽鏈整體表現(xiàn)為親水性，平均疏水性為-0.330。

2.5同源性和進化樹分析

在GenBank中輸入ApHDG12氨基酸序列，運行BlastP，結(jié)果顯示，該氨基酸序列已在蓖麻、毛果楊、Capsella rubella（與擬南芥近緣的薺菜屬一個自交物種）、Eutrema salsuginuem、擬南芥、陸地棉、葡萄、玉米、可可、高粱、山羊草、碧桃等物種里報道過。運行DNAMAN對氨基酸序列進行比對，結(jié)果顯示，AtHDG12基因編碼的氨基酸序列與高粱（Sorghum bicolor；XP_002438026.1）的同源性是50.48%；與碧桃（Prunus persica；EMJ18783.1）的同源性是43.34%；與山羊草（Aegilops tauschii；EMT05677.1）的同源性是45.60%；與Eutrema salsugineum（ESQ35009.1）的同源性是85.71%；與無油樟（Amborella trichopoda；ERN11049.1）的同源性是56.88%；與玉米（Zea mays；AFW73676.1）的同源性是49.93%；與可可（Theobroma cacao；EOY01444.1）的同源性是44.43%；與葡萄（Vitis vinifera；CAN83483.1）的同源性是63.64%；與毛果楊（Populus trichocarpa；ERP52009.1）的同源性是62.92%；與陸地棉（Gossypium hirsutum；AAU12247.1）的同源性是65.33%；與蓖麻（Ricinus communis；XP_002527933.1）的同源性是62.15%；與擬南芥（Arabidopsis thaliana；NP_564041.2）的同源性是9318%；與Capsella rubella（EOA39819.1）的同源性是93.03%。

應用MEGA5.2軟件對13個物種的HDG12氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示，小擬南芥與Capsella rubella、 Eutrema salsuginuem、擬南芥遺傳關系最近，與Capsella rubella聚為一類（圖6）。

2.6ApHDG12蛋白二級結(jié)構預測

利用在線工具HNN對ApHDG12蛋白二級結(jié)構進行預測，結(jié)果顯示，ApHDG12多肽鏈有α螺旋殘基206個，占二級結(jié)構29.99%；β折疊殘基133個，占19.36%；無規(guī)則卷曲殘基348個，占50.66%。利用PSIPRED分析顯示該蛋白擁有19個α螺旋，15個β折疊，無規(guī)則卷曲34個（圖7）。運用COILS對ApHDG12編碼的氨基酸序列進行卷曲螺旋（coiled-coil）預測（圖8），結(jié)果顯示，第一個coiled-coil模式序列位于31～45區(qū)域；第二個coiled-coil模式序列位于47～61區(qū)域；第三個coiled-coil模式序列位于69～111區(qū)域。

2.7ApHDG12蛋白三級結(jié)構同源建模

選擇同源建模SWISS-MODEL CPHMODELS對ApHDG12蛋白建模，用DeepView觀察其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該蛋白由兩部分結(jié)構域組成（圖9），第一部分由18～79位氨基酸組成的同源異型結(jié)構域（homeodomain）（圖10-A），以雞engrailed 2 homeodomain蛋白同源異型結(jié)構域為模板；第二部分由206～436位氨基酸組成的START結(jié)構域，以人類類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白（human phosphatidylcho line transfer protein）START結(jié)構域為模板（圖10-B）。

2.8植物表達載體的構建

為模板，克隆得到兩端帶有酶切位點的基因片段，克隆方法同上。將該質(zhì)粒用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切回收基因片段，同時BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pBI121質(zhì)粒，回收載體大片段，經(jīng)T4連接酶連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)，PCR鑒定后，質(zhì)粒用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切進行鑒定，酶切產(chǎn)物在3kb處，即為插入的目的基因片段（圖11），表明植物過表達載體已構建成功。該植物表達載體包括完整的NPTⅡ篩選標記，CaMV 35S啟動子，NOS終止子（圖12）。

2.9pBI121：：HDG12轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將酶切驗證正確的pBI121：：HDG12質(zhì)粒，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)

桿菌GV3101細胞，涂布于含有利福平（100 mg/L）、慶大霉素（50 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）的固體LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)36 h后，挑取單克隆，PCR鑒定，擴增片段與PMD18-T：：HDG12擴增條帶一致（圖13），證明pBI121：：HDG12植物表達載體已經(jīng)轉(zhuǎn)入了農(nóng)桿菌GV3101中。

3結(jié)論與討論

干旱是影響全世界農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要問題。利

用轉(zhuǎn)基因方法培育耐旱作物品種是實施農(nóng)業(yè)節(jié)水的一個重要途徑，具有周期短、資源豐富的優(yōu)勢。近年來，越來越多的同源異型域——亮氨酸拉鏈基因被克隆，并證實具有特殊的功能。

棉花GbML1屬于HD-zipⅣ基因家族，NM端的同源異型域（HD）和不完整的亮氨酸拉鏈結(jié)構（LZL）專一的L1盒，控制LI層相關基因的表達。START結(jié)構域和SAD結(jié)構域共同完成與GbMYB25蛋白的結(jié)合，經(jīng)采用片段缺失法，通過酵母雙雜交手段驗證，只有完整的START結(jié)構域和SAD結(jié)構域存在時，GbML1蛋白和GbMYB25蛋白才能相互作用[16]，說明HD-zipⅣ蛋白的HD-LZL結(jié)構專一結(jié)合DNA結(jié)合位點，START-SAD結(jié)構與相關蛋白結(jié)合，行使特定功能。

AtHDG12基因在突變時，擬南芥表現(xiàn)出與野生型相同的表型，表明了AtHDG12為冗余基因；與AtHDG11基因雙突變時表現(xiàn)出了比野生型和AtHDG11單突變時更為顯著的表型—表皮毛分支數(shù)明顯增加，多于野生型和HDG11基因單突變時的表皮毛分支數(shù)[2]，有可能暗示著HDG12基因與HDG11基因在植物中表達調(diào)控時具有相互作用。AtHDG11過表達使得擬南芥和煙草都表現(xiàn)出氣孔密度降低、主根增長和側(cè)根數(shù)量增加的表型，提高了擬南芥和煙草的耐旱性[6]。AtHDG12和AtHDG11為一對等位基因，是否AtHDG12也具有類似于AtHDG11一樣的功能尚不明確，有待于實驗驗證。

我們從小擬南芥中克隆得到了ApHDG12，對其進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)ApHDG12具有HD-zip基因家族的特征，在氨基酸的理化性質(zhì)方面二者存在明顯的差異，在homeodomain域中的第5位氨基酸發(fā)生了變異，是否是這一位的氨基酸突變會改變蛋白功能，還需要進一步的實驗證明，同源性分析其與擬南芥近緣種Capsella rubella親緣關系最近，次之為擬南芥。卷曲螺旋預測，在homeodomain結(jié)構域中存在3個卷曲螺旋結(jié)構，與homeodomain結(jié)構域功能相符合，ApHDG12氨基酸序列不論從保守序列預測還是三級結(jié)構建模預測，只預測到了同源異型域和START結(jié)構域，不完整亮氨酸拉鏈結(jié)構（LZL）和SAD結(jié)構域沒有預測到，也許是因為生物信息學在線分析工具存在一定局限性，不能完整預測蛋白結(jié)構。同時我們構建了pBI121：：HDG12植物表達載體，轉(zhuǎn)化了農(nóng)桿菌GV3101，為我們后續(xù)將該基因轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥和煙草分析其功能提供了依據(jù)。

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