藍翹解毒口服液質量標準的改進

鞏偉 李興東 孫旭 趙慶華 張欣欣 張琨 趙梅

[摘要] 目的 對藍翹解毒口服液的質量標準進行改進。 方法 采用薄層色譜法（TLC）鑒別制劑中的板藍根，氣相色譜法（GC）鑒別制劑中的廣藿香，高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中連翹苷的含量。 結果 TLC法鑒別供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點；GC法檢測供試品色譜中呈現與對照品色譜峰保留時間相同的色譜峰；HPLC法含量測定中連翹苷在9.387～300.4 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好（r=0.9999，n=6），加樣回收率為99.62%，RSD為1.21%（n = 9）。 結論 本研究建立的方法結果準確，穩定性好，專屬性強，改進后的質量標準可用于藍翹解毒口服液的質量控制。

[關鍵詞] 藍翹解毒口服液；薄層色譜法；氣相色譜法；高效液相色譜法；板藍根；廣藿香；連翹苷

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）01（c）-0095-05

藍翹解毒口服液為《解放軍醫療機構制劑規范》2002年版收載品種[1]，臨床用于預防和治療病毒性感冒、病毒性腦炎等。該藥處方由板藍根、蘆根、山豆根、郁金、連翹、石膏、石菖蒲、廣藿香、荊芥、地黃、知母等11味中藥組成。該藥原質量標準中僅有針對山豆根和連翹的薄層色譜鑒別等檢驗項目，無含量測定。在軍隊醫療機構制劑標準提高工作展開之際，為更有效地控制藍翹解毒口服液的質量，本試驗對其質量標準進行提高，其中采用薄層色譜法（TLC）對板藍根進行定性分析，氣相色譜法（GC）法對廣藿香進行定性分析，高效液相色譜法（HPLC）對連翹進行定量分析，現報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GC2010氣相色譜儀（日本島津公司）；LC-20AT液相色譜儀（日本島津公司）；AUW220D電子分析天平（日本島津公司）；Synergy-UV超純水器（法國Millipore公司）；TLA-1薄層觀察分析儀（湖南長沙克羅瑪科技有限公司）。

1.2 試藥

板藍根對照藥材（批號：121177-201105），亮氨酸對照品（批號：140687-200401），精氨酸對照品（批號：140685-201003），百秋李醇對照品（批號：110772-201105），連翹苷對照品（批號：110821-201112，含量測定以95.3%計算），以上標準物質均購自中國藥品生物制品檢定研究院；乙腈、萘為色譜純（Honeywell），水為自制超純水，硅膠G薄層板購自煙臺市化學工業研究所（批號：120924），其他試劑均為分析純。藍翹解毒口服液為濟南軍區聯勤部2014年度抽驗制劑品種（規格每支裝10 mL，批號：20140108、20140224、20140128、20130923，生產單位分別為解放軍第一五四醫院、第一五五醫院、第一五九醫院、第三七一醫院，陰性對照制劑委托解放軍第三七一醫院配制）。

2 方法與結果

2.1 TLC法行板藍根定性分析

取本品10 mL，蒸干，殘渣加稀乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺板藍根的陰性對照制劑10 mL，同法制成陰性對照溶液。另取板藍根對照藥材1.0 g，加稀乙醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇2 mL使溶解，制成對照藥材溶液。再取亮氨酸對照品、精氨酸對照品適量，加稀乙醇制成每1毫升各含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2]附錄34-35試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（19∶5∶5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上應顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。薄層色譜圖見圖1。

2.2 GC法行廣藿香定性分析

取本品100 mL，置500 mL圓底燒瓶中，加水100 mL與玻璃珠數粒，連接揮發油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加入環己烷2 mL，連接回流冷凝管，加熱回流2 h，冷卻，取環己烷液，加入適量無水硫酸鈉，振搖，取上清液作為供試品溶液。另取缺廣藿香的陰性對照制劑100 mL，同法制備陰性對照溶液。另取百秋李醇對照品適量，加環己烷制成每l毫升含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照氣相色譜法[2]附錄38-39試驗，用以5%苯基甲基聚硅氧烷為固定相的毛細管柱（柱長為30 m，內徑為0.32 mm，膜厚度為0.25 μm）；柱溫為程序升溫：初始溫度170℃，以每分鐘2℃的速率升溫至180℃，保持2 min，再以每分鐘10℃的速率升溫至230℃，保持2 min；進樣口溫度為230℃；檢測器溫度為250℃；分流進樣，分流比為50∶1。分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各1 μL，注入氣相色譜儀。供試品色譜中應呈現與對照品色譜峰保留時間相同的色譜峰，陰性對照無干擾。氣相色譜圖見圖2。

2.3 HPLC法行連翹定量分析

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（23∶77），流速：1.0 mL/min；檢測波長：277 nm；柱溫為室溫；自動進樣器進樣，進樣量為10 μL；理論板數按連翹苷峰計應不低于5000，陰性對照無干擾。液相色譜圖見圖3。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取連翹苷對照品19.70 mg，置25 mL量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，以70%甲醇為溶劑制成不同質量濃度的對照品溶液。該系列的連翹苷對照品溶液的最終質量濃度分別為9.387、18.77、37.55、75.10、150.2、300.4 μg/mL。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品25 mL，用乙酸乙酯振搖提取6次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加70%甲醇溶解，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3.2.3 陰性對照溶液的制備 另取缺連翹的陰性對照制劑25 mL，同法制備陰性對照溶液。

2.3.3 線性關系考察

取“2.3.2”項下配制的系列對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀進行測定。以質量濃度（μg/mL）為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得連翹苷的回歸方程為Y=456.8X-19.27（r=0.9999，n=6）。結果表明，連翹苷在9.387～300.4 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液（質量濃度為75.10 μg/mL），連續進樣6次，連翹苷峰峰面積的RSD為0.82%（n=6），表明精密度良好。

2.3.5 重復性試驗

取藍翹解毒口服液（批號：20130923）25 mL，按“2.3.2”項下方法制備，平行試驗6份。結果連翹苷的平均含量為97.28 μg/mL，RSD=0.88%（n=6），表明方法重復性良好。

2.3.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0、4、8、12、16、24 h分別測定峰面積。結果，連翹苷峰面積的RSD為1.15%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗

精密量取已知連翹苷含量的樣品（批號：20130923，含量為97.28 μg/mL）9份，分別按低、中、高加入連翹苷對照品，按“2.3.2”項下方法制備，測定峰面積并計算回收率，結果見表1。

2.3.8 樣品含量測定

取4批藍翹解毒口服液，按“2.3.2”項下方法制備并測定連翹苷的含量，測定結果見表2。

3 討論

該制劑處方中，板藍根[2]191苦寒清泄，擅清熱解毒，更擅涼血利咽，直折里熱，連翹[2]159-160性苦微寒，善清降之中兼能升浮宣散，能表里氣血俱清，二者共為君藥，同行清熱解毒，涼血消腫之功；山豆根[2]25-26性苦寒，功專清泄，廣藿香[2]42-43辛散溫運，芳香化濁，兩者一泄一發，相須為用，更助君藥之力，共為臣藥。根據《國家藥品標準（中藥）研究制定技術要求》[3]，應對上述4味藥進行定性定量分析。原質量標準中僅有針對山豆根和連翹的薄層色譜鑒別，無含量測定，本試驗在其基礎上，擬增加針對板藍根和廣藿香的定性分析，增加針對連翹的定量分析。

3.1 板藍根的定性鑒別

現代研究表明，板藍根化學成分豐富[4]，抗病毒作用明顯[5-8]，臨床應用廣泛[9]。其中，亮氨酸、精氨酸等氨基酸類成分為板藍根的重要藥理活性成分，含量可達8%[10]。本試驗通過TLC法對板藍根進行鑒別[11]，方法參照《中國藥典》2010年版一部板藍根鑒別項下方法進行[2]191。原方法對照溶液選用板藍根對照藥材、精氨酸對照品，本試驗在此基礎上增加了亮氨酸對照品，斑點顯色清晰，色譜分離效果良好，操作方便，專屬性強，可以有效對之進行鑒別。

3.2 廣藿香的定性鑒別

廣藿香的藥用成分主要是揮發油，廣藿香油中含有較多的醇類、酮類、醛類等化合物，其中百秋李醇是其代表性活性成分[12-13]。本試驗通過GC法檢測制劑中的百秋李醇[14]，從而對廣藿香進行鑒別。試驗中，首先通過揮發油測定法制備揮發油，然后通過GC法鑒別揮發油中的有效成分百秋李醇。GC法檢測靈敏度高，專屬性強，可以有效地對廣藿香進行鑒別。

3.3 連翹苷的定量分析

連翹苷為連翹的主要有效成分之一[15]，結合文獻報道[16-17]，本試驗采用HPLC法測定制劑中連翹苷的含量。

制備供試品溶液時，通過乙酸乙酯萃取，可以有效除去制劑中的干擾成分，提高連翹苷的提取率。測定波長、流動相、提取溶劑均參照《中國藥典》2010年版一部[2]159-160。選擇色譜柱時，考察了Agilent zorbax extend C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Shimadzu VP-ODS色譜（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil KR100-5-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）等4種色譜柱，結果表明4種色譜柱的峰形、理論板數、分離度均良好，無顯著性差異，最終選擇Inertsil ODS3（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行方法學考察和樣品含量測定。

根據《中國藥典》中藥質量標準分析方法驗證指導原則的要求[2]附錄130-131，含量限（幅）度的制訂，應根據投料飲片、中間體轉移率的實際情況確定。本次測定了4批藍翹解毒口服液中連翹苷的含量，其值分別為90.06、82.94、85.24、97.28 μg/mL，平均值為88.88 μg/mL，上述數據為藍翹解毒口服液中連翹苷的含量限度的確定提供了參考。HPLC法測定結果準確，穩定性好，專屬性強，可以有效測定制劑中連翹苷的含量。

綜上所述，本試驗對藍翹解毒口服液的質量標準進行了提高，其中TLC法鑒別板藍根操作方便、專屬性強，GC法鑒別廣藿香靈敏度高、專屬性強，HPLC法測定連翹苷的含量結果準確、穩定性好，可以用于藍翹解毒口服液的質量控制。因此，可將板藍根的TLC鑒別、廣藿香的GC鑒別、連翹苷的含量測定列入藍翹解毒口服液的原質量標準中，從而對其進行提高。

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（收稿日期：2014-10-03 本文編輯：衛 軻）