梯度劑量放射對兔髁狀突組織學結構影響的研究

廖云陽， 張緯建， 陳芳川， 邱　宇， 林李嵩

梯度劑量放射對兔髁狀突組織學結構影響的研究

廖云陽， 張緯建， 陳芳川， 邱宇， 林李嵩

摘要:目的采用梯度劑量放射線照射兔顳下頜關節，動態觀察研究兔髁狀突的組織學改變。方法取新西蘭兔63只，分為未放療組和放療組，未放療組作為空白對照，不做任何處理，用于收集正常顳下頜關節資料；放療組兔隨機分為A～F 6個劑量組，采用梯度劑量行顳下頜關節區放射，劑量分別為10.8，16.2，21.6，27.0，32.4，37.8 Gy，于放療后1，3，6月每組各處死3只，完整切取顳下頜關節，H-E染色后光鏡下觀察兔髁狀突組織學改變。結果放療后髁狀突軟骨纖維層疏松、玻璃樣變性，纖維間的間隙增寬，增殖層細胞變形、排列紊亂，肥大層、增殖層和鈣化軟骨層均有不同程度的變薄，層次不明顯，細胞數量減少；放療后關節結構的組織學改變的嚴重程度隨著放療劑量的增大及放療后時間的延長而越趨嚴重，F組的關節結構破壞最為嚴重，且6月組較1，3月組嚴重。結論放療在早期導致顳下頜關節在組織學上出現一系列退行性變，且這種改變隨著放療劑量和放療后時間的延長而加重，但期間并未出現關節強直的組織學改變。

關鍵詞:放射療法； 放射治療劑量； 下頜骨髁狀突； 組織學； 組織學，比較； 兔

作者單位: 福建醫科大學 附屬第一醫院口腔頜面外科，福州350005

在頭頸部惡性腫瘤的治療中，盡管目前的手術及修復水平有了一定提高，但仍有一半以上的患者需要輔助放療或放化療，以提高治療效果[1]。放射治療在減少局部復發、控制遠處轉移和提高患者生存率方面發揮了重要作用。但放射線在殺死腫瘤細胞的同時，對機體的正常組織也會造成一定程度的損害，并導致一系列并發癥狀的出現，進而影響患者的生活質量[2]。已有文獻報道，放療引起的張口困難可能是由于高劑量照射后咀嚼肌群的破壞和纖維化，繼而出現關節外強直[3]。但對于顳下頜關節的組織結構在放療后會出現什么樣的變化，是否也會導致關節強直的出現，目前尚不得而知。因此有必要對放療后顳下頜關節組織結構的變化做進一步的研究。

1材料與方法

1.1動物新西蘭兔63只，雌雄不限，3月齡，體質量2.0~2.5 kg[上海生旺實驗動物養殖有限公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0007]，喂養于福建醫科大學實驗動物中心，用標準兔復合飼料喂養。所有動物單籠喂養1周，觀察無牙齒缺失、無全身疾患后納入本實驗。實驗過程均按照IACUC的要求照顧和處理動物，并經動物倫理委員會同意。

1.2儀器與試劑戊巴比妥鈉(德國分裝)，進口脫鈣液(Rapid Cal.ImmunoTM，福州邁新生物技術開發有限公司分裝)，10%甲醛溶液。光學顯微鏡(日本Olympus公司)；組織切片機(英國Therm Shandon公司)；生物組織包埋機(孝感市宏業醫用儀器有限公司)；瓦里安Clinac 600C/D直線加速器(美國通用公司)。

1.3方法

1.3.1實驗分組將63只新西蘭兔隨機分為未放療組和放療組，未放療組9只作為空白對照組，不做任何處理，并于1，3，6月各處死3只，用于收集正常髁狀突的組織學資料。放療組隨機分為A~F 6個不同劑量組，放療總劑量分別為10.8，16.2，21.6，27.0，32.4，37.8 Gy，建立顳下頜關節放射治療動物模型。

1.3.2兔放療動物模型的建立將新西蘭兔固定于自制木箱，于體表定位顳下頜關節部位，畫出定位標志線，前界為眼外眥，后界為外耳道前緣，內界至髁狀突內側1 cm。定位后用直線加速器照射，能量為6 mV，輸出量為108 rad/min，源皮距100 cm，照射野大小為2 cm×3 cm，以左側顳下頜關節作為照射側。放療組均接受照射，每次劑量5.4 Gy，隔天1次。

1.3.3組織學觀察A~F組兔子建立放療動物模型后，于放療后1，3，6月各處死3只。采用耳緣靜脈注射空氣將動物處死，雙側耳前區備皮，消毒，采用耳屏前切口，逐層切開皮膚、皮下組織，剝離關節淺層軟組織，顯露顳下頜關節，在其外1.0 cm處切斷軟組織及骨組織，切取完整雙側顳下頜關節。將標本取材固定、脫鈣、脫水、H-E染色后，觀察髁狀突的組織學結構改變。

2結果

2.1正常髁狀突的組織學表現正常髁狀突表面為纖維軟骨，由淺入深為纖維層、增殖層、肥大層、鈣化軟骨層和軟骨下骨組織。纖維層膠原纖維排列方向大致與髁狀突表面平行，其中偶見細胞成分；增殖層有大量密集排列的細胞，細胞較小且胞質少，細胞核深染；肥大層細胞較為肥大，排列成串珠狀，與關節表面垂直，由深層向淺層體積逐漸變??；鈣化軟骨層軟骨細胞逐漸移行鈣化為骨小梁(圖1A)。

2.2放療后髁狀突的組織學變化(1)放療后1月：A~C組雙側髁狀突在組織學上和空白對照組均無明顯差異。D組放療側髁狀突軟骨的可見纖維層排列疏松，增殖層和肥大層變化不明顯；鈣化軟骨層、軟骨下骨與對照組比較變化不明顯。E~F組放療側髁狀突纖維層明顯疏松，纖維間的間隙增寬，髁狀突軟骨各層次尚清晰，但細胞數量略有減少(圖1B)。(2)放療后3月：A～B組髁狀突軟骨的變化與對照組比較并不明顯，偶見排列疏松的纖維，細胞形態及數目都未見明顯變化；C組纖維層疏松，增厚，局部有裂隙，增殖層和肥大層細胞變化不明顯，層次清晰；D～E組的髁狀突軟骨的組織學變化相似，纖維層疏松，纖維間的間隙增寬，表面不光滑，肥大層、增殖層細胞數量略有減少；F組髁狀突軟骨表層的纖維層排列更為疏松，局部可見纖維層剝脫，增殖層、肥大層和鈣化軟骨層均有不同程度的變薄，細胞數量減少，軟骨下骨結構正常(圖1C)。(3)放療后6月：A～B組纖維層偶見疏松，增殖層及肥大細胞層結構層次清晰，軟骨下骨骨板增厚，骨小梁增粗；C組纖維層排列稀疏，局部出現剝脫、變薄，細胞數量略有減少；D組纖維層排列稀疏，可見裂隙，細胞數量減少，增殖層及肥大細胞層變薄，層次不明顯，細胞排列紊亂，增殖層細胞變形，細胞數量明顯減少；E組纖維層排列稀疏，增殖層、肥大層細胞數量明顯減少，細胞核變小，軟骨各層界限不清，軟骨下骨板增厚，局部可見骨小梁與髁狀突表面平行，骨髓腔內可見炎性細胞浸潤(圖1D)；F組纖維層剝脫消失，表面不光滑，增殖層、肥大層細胞數量減少，骨小梁稀疏，排列紊亂(圖1E)。

A：正常髁狀突，☆纖維層、△增殖層、○肥大層；B：放療后1月，F組纖維間隙增寬；C：放療后3月，F組髁狀突軟骨變薄，細胞數量減少；D：放療后6月，E組各層細胞減少，骨板增厚；E：放療后6月，F組軟骨變薄，層次不清，細胞減少.圖1　髁狀突的組織學觀察(H-E染色　×100)Fig 1　Histological observation of condyle(H-E　×100)

3討論

3.1照射方法選擇為了實驗操作簡便且可模擬臨床放射治療，本實驗采用低分割多次照射[4]，每次劑量5.4 Gy，隔天照射1次，根據生物等效劑量LQ公式[5]：BED=nd[1+d/(α/β)](n為照射次數，d為分次劑量，α/β值在顳下頜關節中近似3)，進行等劑量效應轉換，可計算出A~F組的放療劑量為10.8，16.2，21.6，27.0，32.4，37.8 Gy,分別相當于臨床常規分割照射劑量的20，30，40，50，60，70 Gy。此劑量范圍基本可以覆蓋臨床上常規二維放療及調強放射治療中顳下頜關節的照射劑量。

3.2劑量、時間與損傷程度的關系動物顳下頜關節的退行性變包括：髁狀突軟骨層變薄，細胞排列疏松，數量減少，表面前軟骨細胞增殖抑制，軟骨再生能力下降；髁狀突表層鈣化軟骨帶消失，關節負重能力下降[6]。本研究采用梯度劑量照射，放療后1月，A~C 3個劑量組放療側的髁狀突未見明顯異常變化；當劑量達到D組27.0 Gy的時候，開始出現髁狀突軟骨的纖維層排列疏松，而增殖層和肥大層變化不明顯；隨著劑量的增加，E~F組的變化較D組更為明顯，髁狀突各層次細胞數量開始有所減少。放療后3月，C組開始發生病理變化，D~F組的髁狀突組織學變化較放療后1月更為明顯，且隨著時間及劑量的增大而加重，E~F組的細胞數量明顯減少。放療后6月，A~B組的髁狀突纖維層偶見疏松，增殖層及肥大細胞層結構層次清晰，軟骨下骨骨板增厚，骨小梁增粗；C~F組隨著劑量的增加，髁狀突的組織學改變越明顯，其嚴重程度也比放療后3月時加重。

在放療后6月內，A組的劑量并未對髁狀突產生明顯的影響，在短期內是相對安全的劑量，此劑量相當于臨床上常規分割照射的20 Gy。放療后1月，劑量為27.0 Gy的D組髁狀突開始出現一定程度的病理改變，C組到放療后3月也開始出現髁狀突的病理損害。在本研究中，放療后6月內，劑量達到C組的21.6 Gy時，髁狀突便開始出現比較明顯的組織病理改變，通過短期的研究觀察，可以將21.6 Gy視為髁狀突早期損傷的閾值，隨著劑量的增大，其出現損傷的程度逐漸加重。根據生物等效劑量轉換，本實驗中劑量21.6 Gy相當于臨床上常規分割照射的40 Gy，這也提示在臨床放療過程中，當顳下頜關節照射劑量達40 Gy時，可能會導致顳下頜關節發生早期的放射性損傷。

3.3顳下頜關節與下頜骨放射性損傷的差異由于頜骨放射性骨壞死臨床上更為常見，研究者們更多的把焦點放在頜骨放射性骨壞死的研究上。然而，頜骨放射性骨壞死的機制目前尚不明確，有“放射線、創傷、感染”三因素理論，有目前被廣泛接受的“三低”理論(低氧、低細胞、低血運)[7-8]；近年來，有學者提出了放射性纖維萎縮機制[9]；也有研究認為，是放射線對成骨和破骨細胞的直接損傷所致[10]。目前一些學者在下頜骨放射性骨壞死的動物模型研究中發現，下頜骨的組織病理學改變主要表現為骨陷窩空虛，細胞減少，骨髓腔纖維化以及死骨形成等。然而，在本實驗對髁狀突放射性損傷的研究中，髁狀突軟骨主要表現為纖維結構破壞，層次不明顯，細胞減少且排列紊亂等。軟骨下骨組織則主要表現為骨小梁稀疏、排列紊亂，骨髓腔內炎癥細胞浸潤。髁狀突骨組織出現組織學上改變的時間較髁狀突軟骨明顯延遲，6個梯度劑量組中軟骨下骨組織直到放射后6月才開始出現組織學變化，其結構變化以高劑量組最為明顯。對于放射后髁狀突與下頜骨出現的不同表現，分析其原因可能是由于髁狀突軟骨是一種纖維軟骨，其內不含血管，其營養與關節的運動和滑膜分泌的滑液有關，加上關節軟骨本身存在改建與修復能力，這顯然不同于血運豐富的頜骨。因此放射線對髁狀突造成的破壞較下頜骨輕微許多，其放射性損失的機制亦有別于頜骨放射性骨壞死的“三低”理論，值得進一步深入研究。

綜上所述，放療后髁狀突的組織學變化均表現為組織結構的退行性變，與其他大量關于顳下頜關節紊亂病的動物實驗研究中顳下頜關節出現的退行性變結果相似，說明放療后短期內尚未出現張口困難等嚴重并發癥之前，將首先出現顳下頜關節紊亂病的表現，并且放療后髁狀突所出現病理變化的程度將隨著放療劑量及放療后時間的延長而加重。目前，對于放療引起顳下頜關節的損傷，臨床上關注更多的是患者是否出現張口困難。對于放療后早期，尚未出現張口困難之前，顳下頜關節紊亂病的發生發展并未引起人們足夠的重視。本研究發現，放療可能也是導致患者顳下頜關節紊亂的一個重要因素。因此，臨床上有必要在放療后早期就對顳下頜關節進行定期檢查評估，這將有利于顳下頜關節紊亂病的早診斷、早治療，并可以在一定程度上預防顳下頜關節放射性損傷的加重。此外，放療后顳下頜關節的損傷主要表現為組織結構的退行性變，對于放療后出現的張口受限，可能多為關節外肌群及軟組織的纖維化所致，因此在手術治療此類患者時，應重點考慮關節外軟組織的處理。

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(編輯：何佳鳳)

A Study on the Impact of the Histological Structure

of Rabbit Condyle after Gradient Doses Irradiation

LIAO Yunyang, ZHANG Weijian, CHEN Fangchuan, QIU Yu, LIN Lisong

Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

ABSTRACT:ObjectiveTo observe the histological change of the rabbit condlye after gradient doses irradiation.Methods63 New Zealand rabbits were assigned to radiotherapy group and untreated group.We employed the untreated group as blank control which normal TMJ data was collected and no intervention given.The animal subjects in irradiation were further randomly assigned to 6 groups with gradient doses irradiation.The doses for 6 groups were 10.8, 16.2, 21.6, 27.0, 32.4 and 37.8 Gy.The execution for 3 animal subjects in every group with irradiation was performed after 1, 3 and 6 month after initial exposure and histopathological technique were applied.ResultsThe histological result of animal subjects with irradiation indicated that the osteoporosis and hyaline degeneration in condylar cartilage, boarded interval between fibers, deformability and disarrangement of proliferative cells, various instensity of thinning in proliferative zone, hypertrophic zone and calcified cartilage zone, and reduction in cell counts.The histological change of joint with irradiation was positively associated with the dose and time of irradiation.The destruction of joint in F group can be qualified as the most severe among all irradiation groups and 6 months group was more severe than 1 month and 3 months groups.ConclusionsThe radiotherapy is capable of inducing the degeneration in the early stage, and the change is positively related with the dose and duration after radiotherapy.However, there was no histological changes of ankylosis during the experimental period.

KEY WORDS:radiotherapy; radiotherapy dosage; mandibular condyle; histology; histology, comparative; rabbits

通訊作者:林李嵩. Email: dr_lls@163.com

作者簡介:廖云陽(1984-)，男，住院醫師，醫學碩士

收稿日期:2015-08-25

中圖分類號:R-332； R322.41； R782.6； R815； R815.2

文獻標志碼:A

文章編號:1672-4194(2015)05-0298-04