肝細胞癌組織中miR-21、miR-26a及miR-338的表達及意義

陳穎(天津市人民醫院，天津300121)

·臨床研究·

肝細胞癌組織中miR-21、miR-26a及miR-338的表達及意義

陳穎(天津市人民醫院，天津300121)

摘要：目的探討肝細胞癌組織中miR-21、miR-26a及miR-338在肝細胞癌發生發展中的作用。方法選擇本院腫瘤中心組織標本庫的肝細胞癌組織標本30例份(肝細胞癌組)及相應的癌旁組織標本30例份(對照組)，采用Real-time PCR法檢測兩組miR-21、miR-26a及miR-338的表達，分析其表達與肝細胞癌患者臨床病理特征的關系。結果肝細胞癌組miR-21的表達高于對照組，miR-26a、miR-338表達均低于對照組(P均<0.01)。肝細胞癌組淋巴結轉移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21相對表達量較高，淋巴結轉移、不伴肝硬化、中低分化者miR-26a相對表達量較高，無淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有門靜脈癌栓者miR-338相對表達量較高(P均<0.05)。miR-21的表達與肝硬化、瘤栓、腫瘤分化和TNM分期等呈正相關( P均<0.05)；miR-26a的表達與肝硬化和腫瘤分化呈負相關(P<0.05)；miR-338表達與腫瘤TNM分期和門靜脈癌栓呈正相關(P均<0.05)。結論miR-21表達增高、miR-26a及miR-338表達降低可促進肝癌的發生及發展。

關鍵詞：肝細胞癌；RNA，小分子干擾；淋巴結轉移

多數肝細胞癌患者確診時已為晚期，預后差[1]。微小RNA(microRNA，以下簡稱miRNA)是一類可負性調控基因表達的非蛋白編碼的RNA家族，與腫瘤的發生、轉移密切相關[5]。miRNA具有多種類型，可作為癌基因或抑癌基因在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。研究發現，多種miRNA在肝細胞癌中的表達異常[1,6]。2010～2014年，我們檢測了30例份肝細胞癌組織標本中miR-21、miR-26a及miR-338的表達情況，探討其在肝細胞癌發生、發展中的作用。

1材料與方法

1.1材料肝組織標本：選擇本院腫瘤中心組織標本庫的肝細胞癌組織標本30例份(肝癌組)及相應的癌旁組織標本30例份(對照組)。兩組均有完整的臨床病例資料，均經病理檢查確診。按國際婦產科協會的分類標準和世界衛生組織分級標準，Ⅰ期4例、Ⅱ期7例、Ⅲ期15例、Ⅳ期4例。患者年齡35～68歲、平均50歲，術前均未接受化學和放射治療。試劑與儀器：Trizol購自Life Technologies公司；SYBR Green PCR Kit購自日本Toyobo公司；M-MLV Reverse TranscritaeKit購自美國ThermoFisher公司；miR-21、miR-26a、miR-338以及U6引物購自廣州銳博生物科技有限公司；熒光定量PCR儀購自Stratagene公司；分光光度計(RS232C)購自德國Eppendorf公司。

1.2miR-21、miR-26a及miR-338表達檢測采用Real-time PCR法檢測兩組miR-21、miR-26a及miR-338的相對表達量。常規Trizol試劑抽提組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度。反轉錄反應體系為10 μL，包括5×反轉錄引物0.5 μL、100 mmol/L dNTP與dTTP混合物0.15 μL、反轉錄酶0.5 μL、5×反轉錄緩沖液2 μL、RNA抑制劑0.5 μL及RNA 1 μg。反應條件：42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min。PCR反應條件：95 ℃、1 min變性，95 ℃、 15 s，60 ℃、1 min，40個循環，以U6為內參照，分別進行數據分析，實驗重復3次。實驗結果采用定量PCR中的相對定量法進行分析，以2-△CT表示miR-21、miR-26a和miR-338的相對表達量，其中△Ct= miRNA目的基因平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3miR-21、miR-26a及miR-338表達與臨床病理特征的相關性分析肝細胞癌患者不同臨床病理特征(包括性別、年齡、TNM分期、有無淋巴結轉移、有無肝硬化、腫瘤分化程度、包膜是否完整、有無門靜脈癌栓)與miR-21、miR-26a及miR-338相對表達量的相關性。

2結果

2.1miR-21、miR-26a及miR-338相對表達量肝癌組miR-21的表達高于對照組，miR-26a、miR-338的表達均低于對照組(P均<0.01)。見表1。

表1　兩組miR-21、miR-26a及miR-338

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2miR-21、miR-26a及miR-338表達與臨床病理特征的相關性①miR-21表達：淋巴結轉移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21相對表達量分別高于無淋巴結轉移、無肝硬化、中低分化及TNM分期Ⅰ～Ⅱ者(P均<0.05)；②miR-26a表達：淋巴結轉移、不伴肝硬化、中低分化者miR-26a相對表達量分別高于無淋巴結轉移、無肝硬化、高分化者(P均<0.05)；③miR-338表達：無淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有門靜脈癌栓者miR-338相對表達量分別高于有淋巴結轉移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ、無門靜脈癌栓者(P均<0.05)。miR-21的表達與肝硬化、瘤栓、腫瘤分化和TNM分期等呈正相關(r=0.675，P<0.05)，miR-26a的表達與肝硬化及腫瘤分化呈負相關(r=0.583，P<0.05)，miR-338表達與腫瘤TNM分期及門靜脈癌栓呈正相關(r=0.627，P<0.05)。3種microRNAs與性別、年齡、包膜完整性均無明顯相關性。見表2。

臨床病理特征nmiR-21相對表達量PmiR-26a相對表達量PmiR-338相對表達量P性別0.3250.4640.367 男21443.1±2.1350.2±2.0281.4±1.2 女9409.2±1.3321.6±1.3234.6±3.0年齡(歲)0.6310.2460.548 ≤5017439.1±2.3378.3±2.4362.4±2.2 >5013426.4±2.0404.5±1.3358.8±2.3TNM分期0.0320.0590.042 Ⅰ～Ⅱ11361.0±2.4402.9±2.0408.2±2.5 Ⅲ～Ⅳ19450.9±2.2389.9±2.0459.1±1.6淋巴結轉移0.0270.0150.008 有19551.2±2.0493.2±1.1321.3±2.1 無11412.7±2.0325.7±1.4465.4±4.0肝硬化0.0350.0410.211 有20491.8±2.2357.6±2.9389.8±2.0 無10390.1±1.1434.4±1.1431.2±2.2腫瘤分化0.0360.0460.056 高9488.2±2.0351.3±2.4411.4±2.3 中低21364.1±2.0473.2±3.0393.4±1.4包膜完整0.2210.3290.176 是8440.5±2.1401.8±2.7411.3±2.0 否22409.5±2.0449.2±3.0385.7±2.3門靜脈癌栓0.0790.1730.040 有10420.2±2.1401.8±2.7483.9±1.2 無20400.2±2.0449.2±3.0349.4±1.6

3討論

肝細胞癌最有效的方法是手術治療，但術后復發和轉移嚴重影響患者預后[2,3]。尋找肝癌特異性的分子標志物有助于肝癌的早期診斷。miRNA作為一種新的調節因子，不僅參與生物的生長和發育等生命過程，而且可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生、發展，影響腫瘤患者的預后。miRNA可通過完全或不完全堿基配對與mRNA分子3′UTR端相結合，從而抑制靶基因的翻譯，參與細胞增殖、細胞凋亡、腫瘤侵襲、轉移等過程。

miR-21在多種腫瘤中均呈過表達，證實其在腫瘤形成過程中起廣泛的致癌作用，具有促進癌細胞浸潤和轉移的功能。敲除腫瘤細胞中miR-21即可顯著上調抑癌基因PTEN的表達水平，通過調控抑癌基因PTEN的表達，影響其下游的磷酸激酶及基質金屬蛋白酶，從而影響肝癌的增殖、轉移和侵襲。研究發現，miR-21表達與乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、結直腸癌等有關，在惡性腫瘤的發病中發揮癌基因的作用[13]。miR-21在肝癌中的作用尚不明確。本研究肝癌組miR-21表達水平高于對照組，淋巴結轉移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21表達水平較高，提示miR-21的表達與淋巴結轉移、肝硬化、腫瘤分化及TNM分期有關。

miR-26a位于人類3號染色體上，在多種組織中均有表達。大量研究表明，miR-26a可抑制鼻咽癌、乳腺癌、肝癌細胞的增殖，但卻可以促進膠質瘤細胞的增殖[14]。因此，miR-26a在不同類型腫瘤中的作用還存在一定的爭議。研究發現，肝癌組織中miR-26a的表達水平降低。本研究肝癌組miR-26a表達水平低于對照組，有淋巴結轉移、不伴肝硬化、中低分化者表達水平較高，提示miR-26a的表達與淋巴結轉移、肝硬化及腫瘤分化有關，miR-26a在肝癌組織中的表達明顯下調。

miR-338的異常表達與多種腫瘤的發生發展相關，可通過抑制腫瘤中促進增殖的基因表達從而加快分化進程，具有抑癌基因的作用[15]。miR-338在肝癌中的表達情況尚不明確。本研究發現，肝癌組miR-338表達水平低于對照組，無淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有門靜脈癌栓者miR-338表達水平較高，提示miR-338的表達與淋巴結轉移、腫瘤TNM分期及門靜脈癌栓有關。

本研究表明，肝細胞癌組織中miR-21表達增高，miR-26a及miR-338表達降低，miR-21可能是肝細胞癌的致癌基因，miR-26a及miR-338可能是肝細胞癌的抑癌基因，且三種microRNA的表達與臨床病理特征存在一定關系，microRNA可能作為肝癌診斷和預后指標提供依據。三種microRNA 可能互為靶點，相互作用，有待于進一步深入研究。

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(收稿日期：2014-11-13)

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)10-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.009