大豆磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇單甲醚2000的制備及其性能研究

陳 龍 衛(wèi)延安

(南京理工大學(xué)化工學(xué)院，南京 210094)

Chen Long Wei Yan'an

聚乙二醇單甲醚－(二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)衍生物(MPEG－DSPE)是兩親性聚合物，它在水中可形成聚合物膠束，這種膠束是一種核－殼結(jié)構(gòu)，尺寸100 nm左右。其通常是用于包覆疏水性藥物，以增加疏水性藥物在人體血液中的溶解度從而發(fā)揮藥效［1］。這種聚合物膠束還可利用聚乙二醇分子鏈段形成的立體位阻層阻礙人體血液內(nèi)高密度脂蛋白的攻擊和細(xì)胞的吞噬從而延長藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，使其不至于在達(dá)到病變部位之前被消耗［2－4］。同時(shí)這種納米聚合物膠束利用EPR效應(yīng)而具有被動(dòng)靶向作用，從而使其在抗癌靶向藥物中得到廣泛的應(yīng)用［5］。

目前抗癌靶向藥物價(jià)格普遍較高，這與藥物本身的原料來源和制備方法有重要關(guān)系，因此選擇低成本的原料和簡便的制備方法較為重要。目前報(bào)道的制備MPEG－DSPE的方法大致分為兩大類，一類是直接使用MPEG與DSPE在羰基二咪唑的作用下縮合制備［6］，另一類為將MPEG的羥基轉(zhuǎn)化為有較高活性的中間體活性酯，然后與DSPE的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵［7－8］。這些制備方法都是使用高純度的DSPE為原料，DSPE的分子量較大且結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，其通常采用柱層析或者全合成方法制備［9－10］，反應(yīng)步驟較多，反應(yīng)困難，產(chǎn)率較低，因此較高純度的DSPE的價(jià)格非常昂貴，因此尋找能替代DSPE的物質(zhì)具有重要意義。

大豆磷脂主要由大豆磷脂酰膽堿(SPC)和大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)組成，它是加工大豆油的一種副產(chǎn)物，價(jià)格便宜，其中SPE中的脂肪酸主要由油酸，亞油酸，棕櫚酸，硬脂酸和亞麻酸組成，存在較多的不飽和脂肪酸，具有軟化血管，降低膽固醇和降低血壓的功能［11－13］。用其作為原料制備的MPEG－SPE不僅成本低于MPEG－DSPE而且更有利于人類心血管的健康。因此研究采用工業(yè)級(jí)大豆磷脂和MPEG2000為原料制備大豆磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇單甲醚2000(MPEG2000－SPE)。由于反應(yīng)是大分子之間進(jìn)行的，為了盡可能提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，我們設(shè)計(jì)將MPEG2000氧化為聚乙二醇單甲醚2000羧基衍生物(CMPEG2000)，而后制備成高活性的聚乙二醇單甲醚2000酰氯。由于大豆磷脂是一種混合磷脂不僅有SPE還含有游離的脂肪酸和其他的磷脂，為此首先采用丙酮萃取的辦法將大豆磷脂中的游離脂肪酸除去，然后利用MPEG及其衍生物(包括MPEG－SPE)在無水乙醚中不溶解的特性將未參與反應(yīng)的磷脂除去。反應(yīng)過程中將產(chǎn)生三乙胺的鹽酸鹽，利用其在四氫呋喃中不溶解的特性將其分離，干燥稱重，用來表征聚乙二醇單甲醚2000酰氯的轉(zhuǎn)化率。具體過程見圖1。

圖1 MPEG－SPE的制備過程圖

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

AVANCE(III)500MHz型核磁共振儀(DMSO為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)):瑞士 Bruker;Nicolet iS1O FTIR型紅外光譜儀:賽默飛世爾科技公司;FL3－TCSPC熒光光譜儀:法國 HoribaJobinYvon;MPEG(Mn=2 000):海安石油化工廠;三氧化鉻:上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;工業(yè)大豆磷脂:廣州倚得磷脂有限公司。

1.2 大豆粉末磷脂的制備

工業(yè)級(jí)大豆磷脂含有一定量的游離脂肪酸，應(yīng)當(dāng)在反應(yīng)進(jìn)行前除去，過程:稱取12 g大豆磷脂加入到100 mL丙酮中，攪拌至固體出現(xiàn)，減壓抽濾，濾餅加入到2支20 mL離心管中，分別加入10 mL丙酮，在4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心2 min，倒出液體，重復(fù)多次，直至離心管中液體無色時(shí)，取出離心管中固體，放入真空干燥箱中室溫干燥24 h。

1.3 CMPEG2000 的制備

參照文獻(xiàn)［14］。

1.4 聚乙二醇單甲醚2000酰氯的制備

稱取2 g CMPEG2000加入到10 mL二氯甲烷中，再向反應(yīng)體系中加入20 mL二氯亞砜［15］，回流反應(yīng)6 h。減壓蒸餾，加入無水乙醚沉淀，抽濾，得到白色固體。

1.5 MPEG2000－SPE的制備

分別稱取 4.0、4.6、5.2、6.0、6.8、7.2 g 大豆粉末磷脂溶解到30 mL三氯甲烷中，移入到150 mL的三口燒瓶中，加入3 mL的三乙胺，磁力攪拌，升溫到45℃，將2 g聚乙二醇單甲醚2000酰氯溶解到20 mL三氯甲烷中，使用滴液漏斗逐滴加入到三口燒瓶中。反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去三氯甲烷和未反應(yīng)的三乙胺。再加入50 mL四氫呋喃沉淀出三乙胺的鹽酸鹽，離心分離，離心管底部固體干燥后稱重，用于計(jì)算聚乙二醇單甲醚2000酰氯的轉(zhuǎn)化率。上層液體旋蒸除去四氫呋喃再加入無水乙醚沉淀出未反應(yīng)的聚乙二醇單甲醚2000酰氯和MPEG 2000－SPE，干燥稱重。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)分析

圖2和圖3為m(大豆粉末磷脂)∶m(羧基化聚乙二醇單甲醚)=3∶1時(shí)產(chǎn)物的紅外和核磁譜圖。IR:1 650 cm－1(—C(O)NH—的羰基伸縮振動(dòng)峰)，1 533 cm－1(—C(O)NH—的氨基面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰)，1 100 cm－1(C—O—C伸縮振動(dòng)峰)1HNMR(DMSO d6):δH=0.83(—CH3，a)，1.21 ～1.28(脂肪酸上的飽和碳—CH2，b)，1.47(—CH2—CH2—COOR，c)，1.98(—CH2—CC，d)，2.07(—NH—C(O)—CH2，e)，2.25(—CH2—COOR，f)，2.72(CC—CH2—CC，g)，3.2(O—CH3，h)，3.3 －3.8(重復(fù)單元—CH2—CH2—O—，i)，3.85(—P—O—CH2—CH2，j)，4.01(—CH2—O—P(O)—，k)，4.12(—NH—C(O)—，l)，4.17(P(O)—O—CH2，m)，4.25(CH2—CH—CH2—，n)，5.05(CH2—CH—CH2—，o)，5.31(—CH CH—，p)。

圖2為產(chǎn)物的紅外譜圖，將大豆粉末磷脂和CMPEG的紅外譜圖進(jìn)行比較，可以看出大豆粉末磷酯的紅外譜圖中1 616 cm－1處出現(xiàn)的是伯氨基的剪式振動(dòng)。CMPEG的紅外譜圖中1 100 cm－1處出現(xiàn)的是C—O—C的伸縮振動(dòng)峰，產(chǎn)物的紅外譜圖中出現(xiàn)的1 650 cm－1處的峰是形成的酰胺鍵的羰基蜂，在1 533 cm－1處出現(xiàn)的是仲酰胺的氨基峰，而在1 616 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰消失，并且在1 100 cm－1處出現(xiàn)了C—O—C的伸縮振動(dòng)峰，由此證明MPEG－SPE的生成。圖3為產(chǎn)物的核磁譜圖，產(chǎn)物在無水乙醚中進(jìn)行多次離心分離，完全除去了未反應(yīng)的腦磷脂和卵磷脂，而從產(chǎn)物的核磁譜圖中可以看到磷脂的特征位移表明MPEG分子鏈已經(jīng)與SPE發(fā)生了反應(yīng)，因此從IR和1HNMR譜圖中證實(shí)反應(yīng)產(chǎn)物含有MPEG－SPE。

圖2 MPEG－SPE的IR譜圖

圖3 MPEG－SPE的1 HNMR譜圖

2.2 反應(yīng)物料最佳的質(zhì)量比

圖4為反應(yīng)物料質(zhì)量比對聚乙二醇單甲醚2000酰氯轉(zhuǎn)化率的影響。聚乙二醇單甲醚2000酰氯轉(zhuǎn)化率通過產(chǎn)生的三乙胺鹽酸鹽的質(zhì)量表述，方法如下:

結(jié)果表明，當(dāng)m(大豆粉末磷脂)∶m(羧基化聚乙二醇單甲醚)=3∶1，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為85.2%，達(dá)到最佳工藝條件。

圖4 反應(yīng)物料質(zhì)量比對聚乙二醇單甲醚2000酰氯轉(zhuǎn)化率的影響

2.3 MPEG2000－SPE的膠束粒徑

MPEG2000－SPE是一種聚合物表面活性劑，當(dāng)其在水中濃度大于臨界膠束濃度時(shí)可形成以疏水鏈端為核，親水鏈端為核的納米膠束，可以用來運(yùn)輸藥物，當(dāng)其達(dá)到一定的納米尺寸時(shí)具有靶向特性。本部分采用透射電子顯微鏡測定MPEG2000－SPE的膠束粒徑，方法如下:稱取一定量的MPEG2000－SPE溶解于水中，常溫放置3 h，使得MPEG2000－SPE在水中形成穩(wěn)定的膠束，滴到銅網(wǎng)上，銅網(wǎng)在室溫下干燥后，加入1%磷鎢酸水溶液負(fù)染，干燥后在透射電鏡上觀察膠束的大小，結(jié)果如圖5所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，MPEG2000－SPE的膠束呈球形，粒徑為30～80 nm。

圖5 MPEG2000－SPE膠束的TEM照片

2.4 MPEG2000－SPE熱力學(xué)穩(wěn)定性研究

MPEG2000－SPE在水溶液中可形成膠束，膠束熱力學(xué)的穩(wěn)定性指的是聚合物膠束向單體解聚時(shí)的濃度，即臨界膠束濃度(CMC)。本試驗(yàn)采用靈敏度較高的熒光探針技術(shù)來測定MPEG2000－SPE的CMC。方法參照文獻(xiàn)［16］。結(jié)果如圖5所示。當(dāng)x= －5.69時(shí)，I384/I373的值發(fā)生突變，說明此時(shí)已到達(dá)CMC，臨界膠束濃度為2×10－6mol/L，小于小分子的臨界膠束濃度10－3mol/L，因此MPEG－SPE的熱力學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于小分子膠束。

圖6 MPEG－SPE濃度對I384/I373值的影響

2.5 MPEG2000－SPE膠束動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性研究

聚合物膠束的穩(wěn)定性通常由熱力學(xué)穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性評價(jià)，其中動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性是指膠束分解為單體的速度，設(shè)計(jì)由正己烷和水形成的乳狀液體系，根據(jù)乳狀液分離一定體積的液體來表征膠束分解為單體的速度，同等條件下與大豆粉末磷脂進(jìn)行對比。操作步驟:用50 mL的蒸餾水溶解0.05 g試樣，置于100 mL的具塞量筒內(nèi)，量取50 mL正己烷，塞上蓋子猛烈振動(dòng)至充分乳化后，立即測定水－油相分開10 mL所耗費(fèi)的時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果表明:MPEG2000－SPE分開10 mL所用時(shí)間為183 s，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大豆粉末磷脂所用時(shí)間6 s，并且當(dāng)MPEG 2000－SPE的乳液分出41 mL體積后油－水不再分離，量筒上部呈現(xiàn)穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)。因此MPEG 2000－SPE的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于大豆粉末磷脂。

表1 不同物質(zhì)的油水兩相分開體積與所用時(shí)間之間的關(guān)系/s

3 結(jié)論

3.1 以MPEG2000和大豆粉末磷脂制備了MPEGSPE，產(chǎn)物經(jīng)IR和1HNMR進(jìn)行了確證。

3.2 探討了反應(yīng)物料投料質(zhì)量比對聚乙二醇單甲醚2000酰氯轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果表明當(dāng)m(大豆粉末磷脂)∶m(聚乙二醇單甲醚2000酰氯)=3∶1時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為85.2%，達(dá)到最佳工藝條件。

3.3 采用透射電子顯微鏡測定MPEG2000－SPE的膠束粒徑，試驗(yàn)結(jié)果表明，MPEG2000－SPE的膠束呈球形，平均粒徑在30～80 nm左右，粒子較均勻。

3.4 采用熒光探針法測定MPEG2000－SPE的臨界聚集濃度以表征其膠束在水溶液中的熱力學(xué)穩(wěn)定性，試驗(yàn)結(jié)果表明 MPEG－SPE臨界聚集濃度為2×10－6mol/L，小于小分子的臨界膠束濃度 10－3mol/L，因此MPEG－SPE的熱力學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于小分子膠束。

3.5 通過測定MPEG2000－SPE對正己烷和水形成的乳狀液的穩(wěn)定性表征MPEG2000－SPE膠束的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明，MPEG2000－SPE分開10 mL所用時(shí)間為183 s遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大豆粉末磷脂所用時(shí)間6 s，并且當(dāng)MPEG－SPE的乳液分出41 mL體積后油－水將不再分離，量筒上部呈現(xiàn)穩(wěn)定的凝膠狀態(tài)。因此MPEG－SPE的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于大豆粉末磷脂。

［1］Li L，Tan Y B.Preparation and properties of mixed micelles made of Pluronic polymer and PEG － PE［J］.Journal of colloid and interface science，2008，317(1):326－331

［2］Langer R.Drug delivery and targeting［J］.Nature，1998，392:5－10

［3］Venkataraman S，Ong W L，Ong Z Y，et al.The role of PEG architecture and molecular weight in the gene transfection performance of PEGylated poly(dimethylaminoethyl methacrylate)based cationic polymers［J］.Biomaterials，2011，32(9):2369－2378

［4］Owens III D E，Peppas N A.Opsonization，biodistribution，and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles［J］.International journal of pharmaceutics，2006，307(1):93－102

［5］Ferrari M.Nanogeometry:beyond drug delivery［J］.Nature Nanotechnology，2008，3(3):131－132

［6］Maeda N，Takeuchi Y，Takada M，et al.Synthesis of angiogenesis－targeted peptide and hydrophobized polyethylene glycol conjugate［J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters，2004，14(4):1015－1017

［7］Klibanov A L，Maruyama K，Torchilin V P，et al.Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes［J］.FEBSLetters，1990，268(1):235 －237

［8］Zalipsky S.Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，1995，16(2):157－182

［9］Martin SF，Josey JA，Wong Y L，et al.General method for the synthesis of phospholipid derivatives of 1，2－O－diacyl－ sn － glycerols［J］.The Journal of Organic Chemistry，1994，59(17):4805－4820

［10］Alcaraz M L，Peng L，Klotz P，et al.Synthesis and properties of photoactivatable phospholipid derivatives designed to probe the membrane － associate domains of proteins［J］.The Journal of Organic Chemistry，1996，61(1):192－201

［11］Panthee D R，Pantalone V R，Saxton A M.Modifier QTL for fatty acid composition in soybean oil［J］.Euphytica，2006，152(1):67－73

［12］Spencer M M，Landau－Ellis D，Meyer E J，et al.Molecular markers associated with linolenic acid content in soybean［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，2004，81(6):559－562

［13］于福寬，孫君明，韓粉霞，等.大豆籽粒中脂肪酸組分快速檢測方法的比較分析［J］.大豆科學(xué)，2011，30(4):626－631

［14］陳龍，衛(wèi)延安.聚乙二醇單甲醚羧基衍生物的制備［J］.精細(xì)化工，2013，30(10):1177－1180

［15］石亮亮.核苷類抗乙肝藥物替比夫定及其前藥的合成［D］.湘潭大學(xué)，2011

［16］Greene A C，Zhu J，Pochan D J，et al.Poly(acrylic acid－b－styrene)amphiphilic multiblock copolymers as building blocks for the assembly of discrete nanoparticles［J］.Macromolecules，2011，44(7):1942 －1951.