1 株短短芽孢桿菌產抗菌物質發酵培養基的優化

夏尚遠

（山東省棗莊市畜牧獸醫局，山東 棗莊277100）

自20世紀50年代美國食品與藥物管理局（FDA）首次批準飼料中可以添加抗生素后，抗生素迅速在畜禽養殖中得到推廣，抗生素在動物疫病預防、控制，促進畜禽生長和穩定社會發展中發揮了重要作用。然而隨著抗生素的濫用和藥物敏感性下降，耐藥菌對畜產品質量安全和人類健康造成了巨大威脅，據統計，我國每年抗生素生產量約為21 萬噸，其中養殖業上用量約9.7 萬噸，每年約有8 萬人因濫用抗生素死亡[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高和環保意識的增強，全球許多國家和地區都禁止或限制在養殖業中添加抗生素，解決抗生素濫用問題刻不容緩，1986 年，瑞典全面禁止在畜禽飼料中添加抗生素。2006 年1 月1 日起，歐盟禁止所有預防性抗菌促生長劑用于食品動物[2]，我國農業部也將全面禁止在動物飼料中添加抗生素。為有效解決食品動物源細菌耐藥性問題，一方面應“謹慎、負責地”使用抗菌藥物；另一方面是加大技術研發力度，研發并推廣應用抗菌肽、中成藥、益生菌等抗生素替代品。

抗菌肽是一類存在于多種生物體內并具有廣譜殺菌特性的一類肽類活性物質，1974 年，瑞典科學家Boman 等人在天蠶蛾蛹血淋巴細胞中首次發現多肽類物質[3]，Yang.J.H[4]等人從水稻樣本中分離出203株抗水稻真菌病害的細菌，其中短短芽孢桿菌1Re14防治水稻葉瘟的效果最高，其防治率高達68.5%。目前科學家已經在細菌、兩棲動物、昆蟲等體內或分泌物中發現出上千種抗菌肽[5]。本實驗室成功分離并鑒定出1 株能對多種動物源性病原菌產生拮抗作用的短短芽孢桿菌，通過對菌株發酵產物分離純化得到了其中一種具有抗菌活性的物質，被命名為Tostadin，該抗菌物質能有效的抑殺多種動物病菌的生長，如大腸桿菌、雞白痢沙門菌、葡萄球菌、黑曲霉、黃曲霉等，應用前景十分廣闊[6]。為進一步提高發酵物質產量，本試驗在前期發酵配方基礎上通過響應面法對配方進一步優化，以期為益生菌工業化生產提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 拮抗菌：短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）由本實驗室分離鑒定并保存。

指示菌：大腸桿菌K12（E.coli K12）由山東農業大學微生物實驗室提供。

1.2 培養基 基礎培養基：土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，牛肉膏5.0 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO41.0 g，KH2PO40.6 g，CaCO33.0 g，H2O 1 L。

種子培養基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，Na-Cl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL。

活化培養基：土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，牛肉膏5.0 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO41.0 g，KH2PO40.6 g，CaCO33.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

初始發酵培養基：葡萄糖2.0%，黃豆餅粉3.0%，淀粉0.6%，CaCO30.2%，MgSO40.4%，蒸餾水1 000 mL。

抗菌物質效價生物測定培養基：上層培養基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL；下層培養基：瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 培養條件 斜面菌種培養條件：接種環劃線接種于活化斜面培養基中，30 ℃培養18 h，4 ℃保存備用。

種子培養條件：刮取斜面菌體2 環接種于裝有50 mL 種子培養基的250 mL 三角瓶中，30 ℃，200 r/min 搖床培養20 h。

發酵培養條件：將上述培養好的種子按照2%接種量，接種于裝有50 mL 液體發酵培養基的250 mL 三角瓶中，30 ℃，200 r/min 搖床培養48 h。

1.4 抗菌物質效價的測定

1.4.1 雙層平板的制備 量取15 mL 已熔化的下層培養基，倒入90 mm 的培養皿中，待冷卻后再倒入8 mL 含3%大腸桿菌K12 菌懸液的上層培養基。

1.4.2 效價的測定 效價的測定采用牛津杯法[7]。將發酵液100 ℃滅菌10 min，冷卻后于5 000 r/min 離心10 min，取250 μL 上清液注入到牛津杯（內徑6±0.1 mm，高10±0.1 mm，外徑8±0.1 mm）中，30 ℃培養6 h，每個樣品重復2 次，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據抑菌圈的直徑大小計算其效價，其效價計算公式為：Y=10[（X-2.6475）/5.9311）]×n（11.3 ＞X ＞14.5），[Y 為濃度U，X 為直徑（mm），n 為發酵液稀釋倍數][8]。

1.5 培養基優化試驗

1.5.1 Plackett-Burman（PB）試驗設計 在前期試驗的基礎上，選取5 種培養基組分（葡萄糖、黃豆餅粉、淀粉、CaCO3、MgSO4）進行PB 試驗設計。其因素水平及編碼見表1，其中低水平“-1”值采用培養基成分的原始濃度，高水平“+1”值為低水平的1.25 倍，響應值為抗菌物質的效價。

表1 PB 試驗設計的因素及其編碼值

1.5.2 最陡爬坡試驗 利用SAS9.0 對PB 試驗數據進行一元線性回歸分析，根據試驗擬合的一次多項式方程找出主要影響因子，并確定最陡爬坡的方向及步長，由此接近最大響應區域，具體的設計參照文獻[9]。

2 結果與分析

2.1 發酵產抗菌物質主要影響因素的篩選 PB試驗設計及結果見表2。

表2 n= 12的PB 試驗設計及響應值

采用軟件SAS9.0 對PB 試驗結果進行方差分析，得到各因素對響應值Y（效價，μg/mL）的影響效果，見表3。

對試驗數據進行分析，并擬合一次回歸方程，其模型為：

抗菌物質效價Y=1566-140A-99B+195C-776D-123E（1）

該方程的R2（adj）為79.3%，表明該回歸方程擬合良好。

由表3 可以看出，影響XDH 發酵產抗菌物質的顯著因素有：葡萄糖（P=0.001）和黃豆餅粉（p=0.020）。而且他們對產素產生負影響，因此要應適當降低這兩個因素的濃度以獲得更大產量。對產素影響不很顯著的其他因素則維持在低水平。

表3 各因素的主效應

2.2 最陡爬坡試驗 根據PB 試驗結果，我們選擇葡萄糖與黃豆餅粉這兩個極顯著的因素進行爬坡試驗，試驗設計及結果見表4。可以看出，當葡萄糖為1.50%，黃豆餅粉為2.72%時，抗菌物質的效價達到了1228.46 μg/mL。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果

3 討論

3.1 本試驗對發酵培養基優化過程為：首先通過Plackett-Burman 試驗確定主要的影響因素葡萄糖與黃豆餅粉，然后通過最陡爬坡試驗確定了其最佳濃度。其效價比初始發酵培養基提高了69.27%。但此研究僅限于搖瓶發酵，仍需要上罐分批發酵進一步驗證。

3.2 幾乎所有的微生物都能利用葡萄糖，選擇適宜的糖濃度將會大大提高產素，然而當糖濃度太高時對菌體生長會產生“葡萄糖效應”，因此為防止葡萄糖效應，在培養基中加入了淀粉，考慮到淀粉的溶解性不好的特點，我們將其濃度定在0.6%。本試驗中選擇了黃豆餅粉作為有機氮源，這不僅節約成本，更重要的是它有利于菌體的生長和生產能力的提高。

3.3 本實驗室分離得到的菌株抑菌譜極廣，對大腸桿菌、沙門菌、黑曲霉、黃曲霉等致病菌有強烈的抑制作用，其中對雞白痢沙門菌的MIC 為0.6274 μg/mL，MBC 為1.2548 μg/mL；對大腸桿菌的MIC 為2.3438 μg/mL，MBC 為4.6875 μg/mL；對葡萄球菌的MIC 為9.3750 μg/mL，MBC 為18.7510 μg/mL，因此具有著廣闊的應用前景[10]。

[1] 成雪.養殖業抗生素濫用的危害及應對措施[J].養殖技術顧問，2013，9：194-195.

[2] 谷巍.抗菌肽在畜牧養殖業中的應用[J].養殖與飼料，2010，10：66-68.

[3] Haizhen Mo，Yang Zhu，Zongmao Chen.Microbial fermented tea-a potential source of natural food preservatives[J].Food science and technology，2007，1-7.

[4] Yang J H，Liu H X，Zhu G M，et al.Diversity analysis of antagonists from rice-associalted bacteria and their application in biocontrol of rice disers [J].Journal of Applied Microbiology，2007.104（1）：91-104.

[5] Enzo A.Tosi，Edmundo Re，Marta E.Ortega，et al.Food preservative based on propolis：Bacteriostatic activity of propolis polyphenols and flavonoids upon Escherichia coli[J].Food Chemistry，2007，104：1025-1029.

[6] Song Z，Liu Q，Guo H，et al.Tostadin, a novel antibacterial peptide from an antagonistic microorganism Brevibacillus brevis XDH[J].Bioresource Technology，2012，111：504-506.

[7] 國家藥典委員會.中國藥典（二部）.北京：化學工業出版社，2005.

[8] 薛東紅.短短芽孢桿菌XDH 的鑒定及其抗菌物質的分離、純化與部分性質研究[D].泰安：山東農業大學，2006：39.

[9] 袁志發，周靜芋.實驗設計與分析[M].北京：高等教育出版社，2000：339-346.

[10] 夏尚遠.短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）XDH 抗菌物質的發酵、分離純化與結構鑒別[D].泰安：山東農業大學，2008：49.