急性酒精性肝損傷小鼠模型及早期診斷指標(biāo)G S TA 1 的研究

劉芳萍，馬 欣，趙常偉，常軼聰，藺月霞，李敏敏，劉穎姝，周 瓊，李 植，李 睿，趙玉林，王德寧，劉景利，夏穎慧，遲 超

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030 ；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱150001）

研究表明，急性酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制與其代謝產(chǎn)物引起的肝臟氧化應(yīng)激[1]及肝細(xì)胞凋亡[2]密切相關(guān)。由于臨床尚無特效藥物治療，其損傷又呈不可逆性，因此研究預(yù)防和早期遏制酒精性肝損傷的有效方法顯得尤為重要。2013年美國FDA 指出傳統(tǒng)的肝損傷黃金指標(biāo)如ALT存在半衰期長，檢測(cè)線高等缺點(diǎn)[3]。GSTA1 是谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）家族中最重要的成員之一[4]，在肝細(xì)胞損傷時(shí)被快速大量釋放入血，在親電子物質(zhì)解毒和清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中起到重要的細(xì)胞保護(hù)作用。在急性肝細(xì)胞損害的各種疾病，如急性病毒性、中毒性和藥物引起的肝炎和缺氧引起的肝損害[5]，可檢測(cè)到GSTA1 含量升高。因此研究GSTA1 在肝損傷中的變化對(duì)肝病早期診斷具有重要意義，并為有效藥物的篩選提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠，體重20±2 g，雄性，清潔級(jí)，購自哈藥集團(tuán)制藥總廠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 乙醇致小鼠急性肝損傷模型復(fù)制 將20 只小鼠隨機(jī)分成模型組和對(duì)照組，每組10 只。試驗(yàn)前小鼠隔夜禁食16 h，模型組按照14 mL/kg 體重劑量灌胃50%乙醇溶液，對(duì)照組不做任何處理。8 h 后各組眼球采血，制備血清，取新鮮肝臟制備肝組織勻漿，置于-80 ℃保存。

1.3 時(shí)間-效應(yīng)試驗(yàn) 80 只小鼠隨機(jī)分成10 組，每組8 只，包括9 個(gè)試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)前小鼠隔夜禁食16 h。試驗(yàn)組按照14 mL/kg 體重劑量灌胃50%乙醇溶液，對(duì)照組給予等體積生理鹽水，于1、2、4、6、8、10、12、16、20 h，眼球采血，制備血清。觀察肝臟顏色、大小、光滑度和韌性。用酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)血清中GSTA1 含量，用賴氏法檢測(cè)血清中ALT 活性。

1.4 劑量-效應(yīng)試驗(yàn) 48 只小鼠隨機(jī)分成6 組，每組8 只，包括5 個(gè)試驗(yàn)組（10、12、14、16、18 mL/kg）和對(duì)照組（給予等體積生理鹽水）。試驗(yàn)前小鼠隔夜禁食16 h，灌胃8 h 后眼球采血，制備血清。觀察肝臟顏色、大小、光滑度和韌性。檢測(cè)血清中GSTA1 含量和ALT 活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（Dunnett′s 法統(tǒng)計(jì)分析）。

2 結(jié)果

2.1 乙醇致小鼠急性肝損傷模型建立 給予乙醇溶液后，8 h 未出現(xiàn)死亡鼠。模型組小鼠在酒精作用8 h 出現(xiàn)精神沉郁、喜臥、嗜睡，剖檢見肝臟顏色黯淡、易碎、被膜緊張。模型組血清ALT 活性顯著升高，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），肝組織中SOD、GSH、GSH-Px 明顯升高、MDA 大幅降低，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），具體見表1。

表1 血清A LT 及肝組織S O D、M D A 、G S H、G S H-Px變化（X±s，n=10）

2.2 時(shí)間-效應(yīng)試驗(yàn) 給予乙醇溶液后，20 h 內(nèi)小鼠未出現(xiàn)死亡。各試驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)不同程度中毒現(xiàn)象。剖檢可見肝臟腫脹、邊緣變?yōu)榧t褐色，韌性減小易碎。各時(shí)間點(diǎn)血清GSTA1 和ALT變化見圖1。乙醇處理2 h，GSTA1 含量變化與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），說明此時(shí)肝臟已有損傷，而ALT 活性在6 h 時(shí)才與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 乙醇處理不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中G S TA 1、A LT 變化 （X±s，n=8）

2.3 劑量-效應(yīng)試驗(yàn) 給予乙醇溶液8 h 后，各劑量組小鼠未出現(xiàn)死亡，但均有不同程度的中毒現(xiàn)象。剖檢可見肝臟色澤不均，質(zhì)脆易碎，部分小鼠膽增大，高劑量組肝臟有出血斑。各試驗(yàn)組血清GSTA1 和ALT 變化見圖2。當(dāng)乙醇劑量為10 mL/kg 時(shí)，GSTA1 含量變化與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）；當(dāng)乙醇劑量為12 mLkg 時(shí)，ALT 的活性變化與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)乙醇劑量為14 mL/kg 時(shí)，ALT 活性顯著升高，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

近年來，隨著酒精消費(fèi)群體的增多，酒精中毒尤其是急性酒精中毒的人數(shù)與日俱增，帶來嚴(yán)重的社會(huì)問題。理想的動(dòng)物模型是研究的前提，酒精灌胃法造模周期短、易復(fù)制、穩(wěn)定性好，無死亡，且符合人類大量飲酒所致急性肝損傷的特點(diǎn)，對(duì)研究酒精性肝損傷發(fā)病機(jī)制和篩選藥物起關(guān)鍵作用[6]。本試驗(yàn)中，模型組MDA 含量顯著升高，SOD、GSH 和GSH-Px 含量顯著下降，說明機(jī)體氧化劑與抗氧化系統(tǒng)平衡被打破，乙醇對(duì)機(jī)體造成氧化損傷；ALT 作為傳統(tǒng)的肝損傷黃金指標(biāo)，血清中活性明顯升高，表明肝臟已嚴(yán)重?fù)p傷。

血清ALT 主要分布在胞漿中，作為肝損傷標(biāo)志物，升高幅度雖能反映出肝細(xì)胞壞死程度[7]，但需要建立在一定量的基礎(chǔ)上，并且檢出時(shí)間較長（＞43 h），檢測(cè)線比較高。GSTA1 分子量小，容易進(jìn)行檢測(cè)，半衰期短（＜1 h），更增加了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)中，在肝損傷初期，模型組GSTA1 的含量先于ALT 活性4 h 開始升高，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，沒有出現(xiàn)異常變化趨勢(shì)，這與其在肝臟中的均勻分布關(guān)系密切；在肝損傷的恢復(fù)期，與ALT 活性比較，GSTA1 含量下降更迅速。GSTA1含量在乙醇劑量較低（10 mL/kg 體重）時(shí)便升高極顯著，且增加量與劑量呈依賴性關(guān)系，ALT 則須達(dá)到一定染毒劑量（≥12 mL/kg 體重）才可以檢測(cè)出明顯變化。GSTA1 在肝臟中含量豐富，主要存在于肝小葉中心細(xì)胞，有更好的特異性，因此對(duì)肝代謝區(qū)的損傷更加敏感[8]。血清轉(zhuǎn)氨酶在檢測(cè)過程中容易受溫度和溶血的影響，而GSTA1 在紅細(xì)胞中不表達(dá)，且理化性質(zhì)較穩(wěn)定，避免了溶血和溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。本研究GSTA1 含量檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法，避免了ALT 在檢出量和檢出時(shí)間上的局限性，結(jié)果通過動(dòng)態(tài)曲線表示，避免了取樣不當(dāng)引起的誤差。

本研究以50%乙醇14 mL/kg 體重劑量灌胃，8 h 可成功復(fù)制急性酒精性肝損傷小鼠模型。從時(shí)間-效應(yīng)上看，GSTA1 比ALT 更靈敏，對(duì)于及早發(fā)現(xiàn)肝病并進(jìn)行防治意義重大；從劑量-效應(yīng)上看，GSTA1 比ALT 檢出限更低，在肝損傷較輕時(shí)便能檢測(cè)出來，能更早、更快反應(yīng)出肝臟變化，便于早期治療。因此，GSTA1 作為急性酒精性肝損傷早期診斷的特異性指標(biāo)，比ALT 更敏感，對(duì)肝損傷的進(jìn)一步研究具有重要的臨床意義。

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