棉酚對雄性小鼠的生殖毒性作用

袁彥波，趙樹臣，侯振中

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030）

棉酚是主要存在于棉花的葉、莖及種子中的一種有機物，是一種黃色結晶粉末，對人類和哺乳類有廣泛的毒性作用。同時，棉酚還具有抗生育作用，對雄性動物的影響比較明顯[1-2]，最早對棉酚的研究是用作男性的避孕藥。已有大量文獻報道棉酚及其衍生物能夠影響精子的生成、成熟、受精，甚至導致不可逆的無精作用，所以被禁止使用。很長一段時間內棉酚都被認作是有毒廢物，但有關棉酚具體生殖毒性機理的研究尚未見有太多詳細的報道。20 d 灌服不同劑量的棉酚對雄性小鼠的生殖系統的的影響,為棉酚生殖毒性的研究提供實驗基礎，也為合理開發利用棉籽餅粕作為畜禽配合飼料及滅鼠提供科學參考。

1 材料

1.1 實驗動物 4 周齡清潔級雄性小鼠48 只，體重20±2 g，由東北農業大學實驗動物中心提供。在室溫條件下常規飼養1 周，適應環境，用于試驗。

1.2 主要試劑 棉酚，羧甲基纖維素鈉，均購自哈爾濱伊事達生物工程有限公司。石蠟、甲醛、PBS、伊紅、蘇木精、乙醇、二甲苯、中性樹膠等。

1.3 主要儀器 全自動石蠟切片機、全自動石蠟包埋機、恒溫箱、熔蠟箱、攤片烤片機、染色機。

2 試驗方法

2.1 分組 將48 只雄性小鼠隨機分為4 組，每組12 只，1 個對照組，3 個試驗組（30 mg/kg·d 組、60 mg/kg·d 組、240 mg/kg·d 組）。

2.2 稱重 每周和處死前分別用電子天平進行稱重并記錄。

2.3 動物染毒及取材 各組小鼠均于每天上午9 點對其進行灌胃染毒1 次，試驗組按30 mg/kg·d、60 mg/kg·d、240 mg/kg·d 劑量灌服由羧甲基纖維素鈉稀釋的棉酚0.4 mL，采用等體積不等濃度的方式，對照組僅灌服等體積的羧甲基纖維素鈉，連續灌胃20 d，第21 天稱重后處死小鼠，剖檢取出睪丸，稱其重量并計算臟器指數，并將睪丸置于4%多聚甲醛固定用于H.E.染色。

2.4 臨床癥狀觀察 灌胃后觀察小鼠活動情況，食物消耗情況。并分別在染毒第7、14、21 天稱量小鼠體重，觀察體重增長情況。

2.5 睪丸形態學觀察 將睪丸經4%多聚甲醛固定24 h 后進行洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色、中性樹膠封片、加蓋玻片，放置恒溫箱中，于光學顯微鏡下觀察。

2.6 統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件對數據進行統計分析。結果以X±s表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。P＜0.01為差異極顯著判斷標準。

3 結果

3.1 棉酚對小鼠臨床癥狀及體重的影響 灌服棉酚的小鼠，在服藥后出現厭食，飲食和飲水量明顯減少，活動能力減弱，出現被毛粗糙凌亂無光澤，高劑量組最為明顯，并且在給藥8 d 后出現死亡情況。中劑量組在給藥13 d 后出現死亡現象，死亡小鼠剖檢后發現胃腸臌氣，有惡臭氣味，其他臟器無明顯眼觀變化。對照組與低劑量組均沒有出現死亡情況。體重變化情況見表1。

各組小鼠初始體質量差異均不顯著（P＞0.05）。灌服棉酚后，試驗第1 周，各組小鼠體重均呈上升趨勢，體重差異都不顯著（P＞0.05）；第2周開始，高劑量組體重開始呈下降趨勢，體重差異顯著（P＜0.05），其他各組體重還呈上升趨勢，與初體重相比，對照組體重差異顯著（P＜0.05）；第3周中劑量組體重開始呈下降趨勢，高劑量組體重差異極顯著（P＜0.01）。低劑量組與對照組，體重仍處于上升趨勢。

表1 棉酚對雄性小鼠體重的影響 單位：g

3.2 棉酚對睪丸臟器指數的影響 與對照組相比，低劑量組睪丸臟器指數差異極顯著（P＜0.01）；中劑量組睪丸臟器指數差異顯著（P＜0.05）；高劑量組睪丸臟器指數差異不顯著（P＞0.05）。說明棉酚對雄性小鼠睪丸發育有抑制作用。見表2。

3.3 睪丸病理組織學觀察 對照組睪丸曲細精管固有結構清晰完整，基膜與間質之間界限清晰平整，間質較少，生精細胞排列緊密，整齊有序，生精細胞無脫落、變性、壞死等異常現象。與對照組相比，低劑量組睪丸結構個別生精細胞排列較疏松，間隙變大，其他的基本沒變化；中劑量組生精上皮層數減少，間隙變大，曲細精管基膜有斷裂現象，部分生精細胞與支持細胞分離，個別曲細精管內可見脫落的生精細胞，可見少量發育成熟的精子。高劑量組曲細精管形態不規則，邊緣不完整，甚至沒有曲細精管管腔，生精上皮變薄、層數減少，間隙增大。各級生精細胞腫大，排列紊亂并且伴隨有細胞缺失和細胞碎裂，出現大量生精細胞脫落到管腔，可見少量發育成熟的精子，甚至沒有發現成熟的精子（見圖1）。

圖1 不同劑量組病理組織學圖片

4 討論與小結

4.1 討論 本文試驗中，通過對4～5 周齡的雄性小鼠灌服不同劑量的棉酚，其體重、睪丸重及其臟器指數均有明顯下降，在一定程度上說明棉酚對小鼠生長發育有一定的影響。試驗結果顯示，棉酚對雄性小鼠體重組間差異有顯著性，灌服240 mg/kg·d 體質量濃度棉酚的小鼠第5 天開始食欲不振、出現肚子臌氣、精神委靡等癥狀，消化機能出現紊亂現象，體重開始出現下降，第8 天開始小鼠有死亡現象，初步顯示了棉酚能夠導致雄性小鼠中毒死亡。特別是對睪丸影響最大，表現為隨著劑量的加大，臟器系數下降，這與李根[3]等研究的結果相符。臟器指數是毒理學試驗中，反應實驗動物對臟器損害靈敏而有效的指標[4]，可以很好的反映藥物對各個臟器的影響，尤其是反映毒性大小的重要指標。臟器指數增加表示臟器有充血、水腫、增生、肥大等變化，臟器指數下降表示臟器萎縮、退行性變化等[5]。H.E.染色結果顯示，低劑量與中劑量組睪丸組織曲細精管結構及生精細胞有不同程度的損傷，高劑量組曲細精管形態不規則，邊緣不完整，內緣排列很不規則，甚至沒有曲細精管管腔，生精上皮變薄、層數減少，間隙增大。有的生精小管管壁變得疏松且遭到破壞，各級生精細胞腫大，排列紊亂并且伴隨有細胞缺失和細胞碎裂，出現大量生精細胞脫落到管腔，可見少量發育成熟的精子，甚至沒有發現成熟的精子。結果與研究報道的棉酚對雄性睪丸生精細胞有破壞作用，可以造成生精上皮細胞凋亡，造成死精、少精，甚至無精子癥相一致[6-7]，表明，棉酚可以使鼠類不能生成成熟的精子，進而降低鼠類的繁殖能力。因此把棉酚應用到滅鼠劑中，可有效解決鼠類的繁殖問題，降低鼠害的發生率[8]。棉酚可以引起小鼠食欲下降，生長很明顯受到抑制，體重下降。

4.2 小結 棉酚對雄性小鼠有一定的毒性作用，能使睪丸發生一定程度上的病理變化及能導致小鼠死亡，但對其機理還有待進一步的研究。

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