鴨源致病性大腸桿菌四環素類耐藥基因檢測

方志超，劉書超，林 雅，簡燕娟，韓冠雙，呂朋沙，程方俊

（1.西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌402460 ；2.重慶交通大學，重慶 南岸400074；3.重慶市大足區農委，重慶 大足402373）

四環素類是一種廣譜抗菌藥物，主要通過阻止細菌蛋白質的合成而發揮抑菌甚至殺菌作用。動物機體中共生大腸桿菌作為耐藥指示菌和四環素耐藥基因的貯存庫，在致病性菌株耐藥性的預測及耐藥基因的傳遞方面起著非常重要的作用，因此調查致病性大腸桿菌對四環素類抗生素的耐藥性和耐藥機制對人類和動物臨床疾病的防控具有重要意義。

目前，對于大腸桿菌耐藥性的研究很多[1-3]，但是，對于重慶地區鴨源致病性大腸桿菌對四環素類藥物耐藥性的研究資料較少，基于此，本試驗采用PCR 技術對重慶地區鴨源致病性大腸桿菌四環素耐藥基因進行檢測，以了解重慶地區大腸桿菌對四環素耐藥差異以及主要耐藥基因的分布情況，這對重慶地區鴨大腸桿菌病提供藥物治療及預防具有重要的臨床指導價值。

1 試驗材料

1.1 菌株 西南大學榮昌校區預防獸醫教研室2005-2011 年在重慶地區分離鑒定并保存的致病性大腸桿菌40 株。

1.2 藥品與試劑 常規質粒提取試劑盒E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I、Gold-view 染色劑、PCR 產物凝膠回收試劑盒均購自廣州飛揚生物工程有限公司；Premix Ex Taq 購自寶生物工程（大連）有限公司。

2 耐藥基因的檢測

用PCR 方法擴增耐藥基因，按照GenBank 公布的tet 基因序列，參考相關文獻[4-7]設計引物（表1）。

按照常規質粒提取試劑盒的說明書嚴格提取大腸桿菌的質粒并作為模板。

表1 PC R 擴增4環素耐藥基因引物的序列

PCR 擴增全部采用25 μL 體系，如表2。tetA、

表2 PC R 擴增反應體系

tetB、tetC 基因PCR 反應條件如表3。tetD、tetK、

表3 tetA 、tetB、tetC 基因PC R 反應條件

tetL 基因PCR 反應條件如表4。

表4 tetD、tetK 、tetL 基因PC R 反應條件

3 試驗結果

3.1 主動外排機制耐藥基因PCR 擴增結果 四環素類耐藥基因tetA、tetB、tetC、tetD 基因的PCR擴增凝膠電泳圖，如圖1-3 所示，擴增產物與目的片段基因大小相符，tetA 為210 bp、tetB 為659 bp、tetC 為418 bp、tetD 為260 bp，未檢測出tetK、tetL 耐藥基因。

圖1～1 tetA 、tetB 基因電泳

圖1～2 tetC 基因電泳

圖1～3 tetD 基因電泳

3.2 主動外排機制耐藥基因檢測結果 在40 株大腸桿菌中，tetB、tetA、tetC 和tetD 基因的檢出率分別為80.0%、75.0%、55.0%和15.0%。其中攜帶tetB 基因的菌株在所有檢測基因中陽性率最大。在本次試驗中，部分菌株同時含有兩種以上

4 討論

耐四環素基因tet 的分布存在多樣性，不同地域、不同宿主及不同細菌都會表現出tet 基因的多樣性。Voskresenskii A M等[8]用32P放射性標記探針對44株志賀氏菌檢查，發現含有tetA的基因占66%，50 株沙門菌中含tetC 基因的占到20%。王曉泉[9]用PCR 方法檢測四環素耐藥基因在84 株雞源沙門菌分離菌株中的分布情況。結果顯示，雞白痢和雞傷寒沙門菌只攜帶tetA 基因。張純萍等[10]對健康雞、豬體內分離出的269 株大腸桿菌進行檢測四環素類耐藥基因，tetA、tetB、tetM 的攜帶比例為87.9%、28.4%、15.5%。

Chiayzn Lee 等[11]報道，腸道菌中tetB 最普遍，對3 個不同豬場糞便中分離的114 株革蘭陰性菌進行了檢測，結果tetB 的檢出率為35%，此外，在預防和治療的選擇性壓力下，tetB 更普遍。

本試驗中，tetB 的檢出率最高，為80%，在所有檢測基因中陽性率最大。tetA 的檢出率為75%，而且所有菌株均可檢測到tetA 或tetB 基因，部分菌株還同時含有兩種以上主動外排機制的基因，這種情況的出現可能與攜帶耐四環素基因的轉座子、接合轉座子或者質粒在細菌間的傳遞有關。此結果與Chiayzn Lee 報道結果相似。本試驗結果說明：tetA 和tetB 廣泛存在于重慶地區鴨源大腸桿菌，是該地區鴨源大腸桿菌對耐四環素類藥物的主要耐藥機制，這與張純萍、王曉泉等人報道有所差異，可能是由于宿主不同，環境不同，用藥情況不同，不同地區的菌株存在tet 多樣性。tetC 的檢出率為55.0%，據報道[12]，tetC 不是大腸桿菌攜帶的主要四環素耐藥基因，而本結果檢出率很高，說明tetC 的耐藥基因近年來，也在重慶地區鴨源大腸桿菌內廣泛存在，應引起重視。本試驗未檢測出tetK、tetL 基因，該類基因主要存在于革蘭陽性菌中，革蘭陰性菌中很少見。

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