兩株不同毒力單增李斯特菌致病性試驗

李曉云，李 巍，伊娜娜，張子群，劉 兵，初純明，宋銘忻

（1.東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030 ；2.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱150001）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種重要的人獸共患食源性病原菌，包括人類在內的40 多種哺乳動物、20 多種飛禽類和部分水生動物均可分離到該菌，可引起人和動物的腦膜炎、胃腸炎、慢性肝炎、敗血癥及死胎、流產等，也有研究表明，感染該菌偶爾可引起皮膚組織的損傷和流行性感冒樣癥狀[1-2]。人類感染率雖然不高，但是感染后很容易發病，平均致死率達20%～30%[3]，在免疫功能缺陷者以及新生兒、孕婦、老年人等免疫力低下人群中更高達70%[4]。不同來源的菌株致病性差異較大，有些菌株致病性很強，而另一些菌株毒力較弱甚至無致病性[5]。為研究不同毒力單增李斯特菌對機體的致病性差異以及機體對不同毒力菌株的免疫應答差異，選取毒力差異顯著的兩株LM（菌株LMo 0586 和LM N21），通過建立不同毒力及菌量的小鼠感染模型（A 組：低劑量攻弱毒、B 組：半數致死量攻弱毒、C 組：半數致死量攻強毒、D 組：過量攻強毒），觀察LM 在小鼠體內的動態分布情況、小鼠機體組織病理學變化并對血清中重要炎性因子IL-12、TNF-α、INF-γ進行動態觀察，為研究單增李斯特菌致病機制及開發新型疫苗載體等工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與實驗動物 菌株LM N21 為本實驗室保存，菌株LMo 0586 為東北農業大學微生物實驗室李一經教授惠贈。本實驗室已完成兩株菌的半數致死量（LD50）測定，LMo 0586 的LD50為105.5、LM N21 的LD50為108.2，兩菌株毒力差異顯著，LM N21為弱毒株，LMo 0586 為強毒株。實驗動物為5 周齡雌性清潔級昆明系小鼠（體重20 g 左右），購自哈爾濱醫科大學第二附屬醫院實驗動物中心。

1.2 培養基及主要試劑 李斯特菌培養基TSBY 和增菌液按照《GB 4789.30-2010 食品微生物學檢驗方法》配制。rTaq 聚合酶、dNTP Mixture、酵母提取物、胰蛋白胨，均購自大連寶生物工程有限公司；細胞因子ELISA 試劑盒，購自RD 公司。

1.3 小鼠感染及分組 兩株不同毒力李斯特菌分別培養，收集菌體并計數，根據菌株的半數致死量（LD50），用PBS 緩沖液調整菌體濃度為105.5CFU/mL和108.2CFU/mL，將小鼠分成4 組（A 組～D 組，40 只/組）進行腹腔注射，每鼠注射0.2 mL 菌液。A組：105.5CFU/mL 的弱毒株LM N21；B 組：108.2CFU/mL 的弱毒株LM N21；C 組：105.5CFU/mL 的強毒株LMo 0586；D組：108.2CFU/mL 的強毒株LMo 0586。同時設對照組若干，腹腔注射生理鹽水，對照組和試驗組的全部小鼠在相同條件下喂飼。

1.4 LM 在感染鼠體內的動態分布檢測 細菌感染后，于2、4、6、8、12 h、1 d、2 d，從各組中隨機取出3只小鼠，斷頸處死，無菌條件下剖取心臟、腦，分別勻漿，將勻漿液抽至EB 增菌液中，37 ℃培養48 h。對培養物進行PCR 檢測，引物參照Deneer 等設計的特異性引物[6]（主要擴增保守的hlyA 基因片段），擴增片段長度為743 bp，PCR 產物以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，出現743 bp 特異性條帶為陽性。

1.5 LM 感染鼠肝臟及腦組織病理學觀察 取感染后12 h、1 d 的小鼠肝組織以及感染1 d 的腦組織制作石蠟切片，以常規方法進行H.E.染色，觀察小鼠肝臟及腦組織的病理學變化。

1.6 小鼠血清重要炎性因子動態變化檢測 于4、8、12 h、1、2、3、5 d 和7 d，從各組中隨機取出3只小鼠，眼球采血，5 000 r/min 離心取血清，使用ELISA 試劑盒檢測各組血清中IL-12、TNF-α、INF-γ細胞因子的表達量，按照試劑盒使用說明書進行操作，用酶標儀測定吸光度（OD）值，通過標準曲線計算樣品中各因子含量。

2 結果

2.1 單增李斯特菌在感染鼠心臟和腦中的動態分布 4 組小鼠均于不同時期在心臟、腦中檢出LM，結果見表1。感染后2 h，C、D 兩組小鼠心臟中就可檢出LM，感染后4 h，這兩組全部小鼠心臟均檢出細菌，此時A、B 兩組還各有1 只小鼠未檢出細菌。感染后6 h，D 組的1 只小鼠腦中檢出LM，至感染后8 h，C、D 兩組各有兩只小鼠在腦中檢出細菌，此時A、B 兩組各有1 只小鼠腦中檢出細菌，至感染后2 d僅有1 只小鼠（A 組）未在腦中檢出細菌。

2.2 感染LM 小鼠狀態及剖檢、組織病理變化 感染后4 組小鼠均出現了不同程度的病態變化：A 組小鼠感染后1 d，部分小鼠出現精神委靡、食欲減少、皮毛無光澤等癥狀，感染后2 d 表現出癥狀的小鼠數量增多，5 d 后，癥狀逐漸減輕至恢復健康狀態，試驗期間內無小鼠死亡。在2 h～6 h 內，各臟器無明顯病理變化，8 h 剖檢的3 只小鼠中有1 只小鼠脾臟稍有水腫，12 h 剖檢的小鼠可見肝臟腫大的病理變化，試驗期間小鼠腦部未見明顯的病理變化。B組小鼠感染后1 d，大部分小鼠除了出現與A組相似的患病癥狀外，還出現了抽搐、點頭、繞圈等神經癥狀，5 d 后癥狀緩解，感染后2 d 開始有小鼠陸續死亡，至試驗結束除正常處死的小鼠外共死亡5 只。6 h 出現脾臟腫大，8 h 有2 只小鼠出現肝臟腫大的癥狀，2 d 時1 只小鼠腦組織出現水腫、出血。C 組小鼠與B組小鼠癥狀類似，感染1 d有1只老鼠死亡，至試驗結束除正常處死的小鼠外共死亡7 只。1 d時即有小鼠腦組織出現病理變化。D組小鼠感染后12 h，就有部分小鼠出現了患病癥狀，感染后1 d，小鼠開始陸續死亡，到第5 天，包括正常處死在內的40只小鼠全部死亡。

顯著組織病理變化如圖1。感染后12 h，A 組小鼠肝細胞無明顯病理變化，B、C、D 組小鼠可見不同程度的肝細胞損傷，部分靜脈細胞脫落進入管腔；感染后1 d，A 組小鼠肝細胞也出現輕微病變，其他3 組肝實質出現壞死，肝細胞溶解，肝靜脈擴張并嚴重充血。A 組小鼠腦組織無明顯病理變化，其余3 組有不同程度的病變，可見腦實質部分出現壞死灶，有微血栓形成。

2.3 感染小鼠血清中重要炎性因子含量變化試驗結果如圖2 所示。小鼠血清中IL-12 僅在LM感染早期有較高的表達量，除D 組在4 h 達到峰值外，其他3 組均在8 h 達到峰值，感染后期4 組小鼠血清中IL-12 的含量與正常組無顯著差異（P＞0.05），單因素方差分析組間差異不顯著（P＞0.05）。小鼠血清中TNF-α在LM 感染早期有較高的表達量，4 組均在8 h 達到峰值，感染后期4 組小鼠血清中TNF-α的含量也略高于正常組，單因素方差分析組間差異不顯著（P＞0.05）。小鼠血清中INF-γ在LM 感染早期有較高的表達量，4 組均在8 h 達到峰值，在感染后期，除A 組僅略高于正常組外，其他3 組均有較高的表達量（P＜0.05），單因素方差分析組間差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

本試驗通過腹腔注射小鼠的方法研究不同毒力及濃度單增李斯特菌的致病性差異。LM 無論是通過何種方式感染動物機體，都需要經過血液循環侵入機體各組織臟器，因此檢測小鼠心臟中細菌動態分布情況對證明小鼠感染模型建立是否成功及探討細菌遷移能力具有很重要的意義。腦炎是LM 的特征性病理癥狀，因此研究腦組織中細菌動態分布情況，對判斷致病力亦是十分重要的。本試驗4 組小鼠在心臟和腦中的動態分布情況不同，其中過量攻強毒株LMo 0586 的小鼠明顯比其他3 組的小鼠更早發現細菌，說明毒力強的LM 在小鼠體內有更強的遷移能力，推測可能是過量的細菌使機體免疫系統不能及時清除細菌，從而導致細菌大量增殖所致；同時發現即使相同毒力（同為半數致死量）的強弱毒株在心臟和腦中的動態分布情況也存在差異，其中，1只感染強毒株的小鼠在感染后2 h 就可以在心臟中檢出細菌，感染后4 h，強毒株組的3 只受檢小鼠都可以在心臟中檢出細菌；而感染后2 h，弱毒株組未在心臟中檢出細菌，感染后4 h 弱毒株組的3 只受檢小鼠中還有1 只小鼠未在心臟中檢出細菌，說明兩株菌遷移能力和運動性存在差異，推測這兩株菌與運動性有關的基因（actA、plcB）發生的點突變可能對細菌毒力變化產生影響[7]。

圖1 小鼠肝臟和腦的病理變化，H.E.染色 （×10）

圖2 4組感染LM小鼠不同時期血清炎性因子含量變化 （pg/μL）

感染李斯特菌后4 組小鼠均出現了不同程度的病理變化。感染的細菌毒力越強，小鼠出現癥狀的時間越早，這與感染鼠心臟及腦中細菌動態分布情況相一致，除感染低劑量弱毒的小鼠未出現明顯的神經癥狀外且試驗期間未出現死亡，其他3 組小鼠都出現了不同程度的神經癥狀，感染同等毒力細菌的兩組小鼠有相似的癥狀及病理變化，感染不同劑量的同菌株的幾組小鼠間病變程度存在差異，感染同等劑量的幾組小鼠間病變程度差異顯著。試驗中4 組小鼠均出現了不同程度的脾臟和肝臟腫大，通過觀察肝臟組織切片，可明顯看出有肝細胞破裂、肝靜脈充血、腦實質充血、壞死等病理變化。肝臟損傷程度與細菌毒力呈正相關，過量攻強毒的小鼠肝臟損傷嚴重；低劑量弱毒株小鼠腦組織無嚴重病理變化，與這組小鼠未出現顯著的神經癥狀相一致，而此組小鼠腦中也檢出細菌，推測是由于增菌后進行PCR 檢測這一方法敏感度過高，實際穿透血腦屏障的細菌數量極低，不足以引起明顯的腦損傷?？梢?，單增李斯特菌對小鼠的致病力存在顯著的劑量及毒力依賴性。

作為一種胞內菌，機體對LM 的免疫反應主要以細胞免疫為主，在感染后機體的整個免疫應答過程中，TNF-α、IL-12 和IFN-γ都在清除LM感染中扮演著重要的角色。本試驗通過檢測小鼠血清中重要細胞因子的動態變化來研究機體對不同毒力LM的免疫應答差異。總體來看，這3 種細胞因子的表達量都呈現出相似的變化趨勢，即在感染早期表達量上升至峰值，隨后逐漸下降至平穩；經組間比較可以看出，除高劑量攻強毒的小鼠比其他3 組小鼠更早的引起機體免疫應答反應外，4 組間無顯著差異?？梢钥闯觯煌玖Φ膯卧隼钏固鼐梢饳C體產生相似的免疫應答。

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