鴨1 型甲肝病毒亞型的鑒定

傅秋玲，陳 珍，黃 瑜，傅光華，陳翠騰，萬春和，程龍飛，陳紅梅，施少華，林建生

（福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州350013）

鴨1型甲肝病毒（duck hepatitis A virus 1，DHAV-1）是小RNA 病毒科（Pacornaviridae）禽肝病毒屬（Avihepatovirus）的成員之一，主要侵害6 周齡內的雛鴨，以發病急、病程短、致死率高、病死鴨呈角弓反張、肝臟腫大、出血為臨床特征。

2005 年Guérin 等自表現胰腺炎和腦炎的番鴨中分離到鴨1 型甲肝病毒，而發病鴨肝臟未出現腫大、出血病變[1]。此后，未見類似病例報道。直至2011 年9 月，福建、浙江、上海、廣東等省份相繼出現10～30 日齡雛番鴨、半番鴨以胰腺泛黃、出血（俗稱胰腺炎）為特征的疫病，其發病率和病死率分別達10%～30%、25%～40%。本研究室對患該病的雛番鴨病例開展了病原學研究，并對已分離到的病毒進行蝕斑純化、形態特征、全基因組測序與分析、生物學及理化學特性和動物致病性試驗等一系列相關研究，結果發現，該病毒呈直徑20～40 nm 的球形粒子；其全基因組序列與DHAV-1 參考毒株核苷酸序列和氨基酸同源性分別介于93.5%～99.6%和97.9%～99.6%之間，結構蛋白vp1 基因與經典的DHAV-1 的vp1 基因序列同源性較高；對家禽紅細胞和綿羊紅細胞無血凝活性[2-4]；雛番鴨和雛半番鴨對該病毒較易感、櫻桃谷雛鴨和雛麻鴨對該病毒不易感，而肝炎型的鴨1 型甲肝病毒卻對櫻桃谷雛鴨最易感，雛番鴨、雛半番鴨對其相對較不易感。綜合以上研究結果，確定其病原為鴨1 型甲肝病毒。但由于其特征性剖檢病變為胰腺泛黃、出血，完全不同于引起典型肝炎的DHAV-1（稱為經典的肝炎型DHAV-1）所致的肝臟腫大、出血特征病變，為區別起見，將其暫定為胰腺炎型DHAV-1[2-4]。

為了明確引起雛鴨胰腺炎的新型DHAV-1 的分類地位，本研究采用固定病毒稀釋血清的方法對胰腺炎型DHAV-1 和經典的肝炎型DHAV-1 進行血清交叉中和試驗，以此分析胰腺炎型DHAV-1 與經典的肝炎型DHAV-1 間的抗原相關性，為對該病毒深入研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 毒株和試驗鴨胚 MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 和FJ1007 株經典的肝炎型DHAV-1 由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所禽病室分離、鑒定和保存。10 日齡鴨胚（無DHAV-1 母源抗體），購自華南生物農大生物藥品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 陽性血清抗體、陰性血清抗體的制備 陽性血清抗體是胰腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）和經典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）病毒液分別經甲醛（終濃度0.1%）滅活后與弗氏不完全佐劑按1∶1 比例進行乳化，首次免疫成年番鴨，間隔2周后，與弗氏完全佐劑乳化后再次免疫，3 免后采集血液制備血清，應用鴨胚中和試驗法測定抗血清效價，56 ℃滅活后分裝凍存備用。陰性血清抗體的制備是采集自無DHAV-1 母源抗體鴨胚孵化而得的雛鴨，56 ℃滅活后分裝凍存備用。

1.2.2 胰腺炎型與經典的肝炎型DHAV-1 鴨胚半數致死量（ELD50）的測定[7]分別對胰腺炎型DHAV-1（MPZJ1206株）和經典的肝炎型DHAV-1（FJ1007株）病毒液用滅菌PBS 進行10 倍系列稀釋，將10-1-10-6每稀釋度按0.1 mL/胚的劑量接種5 枚10 日齡番鴨胚，37 ℃孵育，棄24 h 內死亡胚，繼續孵育1 周并觀察記錄鴨胚死亡結果，按Reed-Meunch法計算ELD50。

1.2.3 血清交叉中和試驗 采用固定病毒稀釋血清法[5]。首先將抗胰腺炎型DHAV-1 MPZJ1206 或經典的肝炎型DHAV-1 FJ1007 陽性血清用滅菌PBS 作倍比稀釋。且將含200ELD50/0.2 mL 的病毒（MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 或FJ1007 株經典的肝炎型DHAV-1）分別與不同稀釋度的陽性血清等量混合，于37 ℃孵育l h。同時，另設病毒、血清和PBS 對照，然后分別將各中和組混合液與對照組混合液按0.2 mL/胚的劑量接種于5 枚10日齡鴨胚尿囊腔內，棄24 h 內死亡胚，記錄1 周內的鴨胚死亡情況，以病毒對照全部死亡及血清、PBS 對照全部存活為試驗成立。試驗組以1 周內有效死亡胚計算半數保護劑量（PD50）。以50%鴨胚保護的最高血清稀釋度為血清的中和效價。

1.2.4 判定標準 參照《動物病毒學》中口蹄疫病毒血清型和亞型的區分標準進行判定[5]，由異源血清與同源血清效價之比得到2 個比值（r1 和r2），即MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 分別與抗經典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）陽性血清和抗腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）陽性血清之間反應測定的效價之比（r1）；FJ1007 株肝炎型DHAV-1 與抗腺炎型DHAV-1（MPZJ1206 株）陽性血清和抗經典的肝炎型DHAV-1（FJ1007 株）血清之間反應測定的效價之比（r2）。再根據公式親緣值（R 值）：R=√r1×r2 計算得出。

2 結果

2.1 胰腺炎型與經典的肝炎型DHAV-1 的ELD50測定結果 MPZJ1206 株胰腺炎型DHAV-1 和FJ1007 株經典的肝炎型DHAV-1 接種10 日齡鴨胚后，每天照胚3 次，統計1 周內鴨胚的死亡數量。按Reed-Meunch 法分別計算MPZJ1206 株胰腺 型DHAV-1 的ELD50為10-5.58/mL 和FJ1007 株 經典的肝炎型DHAV-1 的ELD50 為10-6.69/mL-1。

2.2 鴨胚交叉中和效價及R 值 采用固定病毒（200ELD50/0.2 mL）稀釋血清法對胰腺炎型DHAV-1 毒株（MPZJ1206 株）和經典的肝炎型DHAV-1 毒株（FJ1007 株）進行鴨胚交叉中和試驗。利用交叉中和抗體效價按公式計算兩種間的親緣值（R 值）（表1）：R=√r1×r2=√（89.1/169.8）×（91.2/125.9）=0.62。因此，R 值范圍為0.32＜R＜0.7，表明胰腺炎型DHAV-1 屬于鴨1 型甲肝病毒亞型（DHAV-1a）。

表1 兩種D H A V-1與相應抗血清交叉中和試驗效價及R 值結果

3 結論與討論

鴨甲肝病毒（DHAV）包含3種基因型，分別為傳統的血清1 型鴨甲肝病毒、臺灣新型鴨甲肝病毒和韓國型鴨甲肝病毒（即DHAV-1、DHAV-2 和DHAV-3），在我國主要流行DHAV-1 和DHAV-3[8-11]。雛鴨感染鴨甲肝病毒后多呈現角弓反張臨床癥狀，肝臟呈特征性腫大、出血性病理變化，這些特征性的臨床癥狀及剖檢病變為臨床快速診斷該病提供重要依據。直至2011 年下半年，我國浙江省金華、麗水等地及福建省的莆田、福州等地7～30 日齡的雛番鴨發生以胰腺泛黃、出血（暫稱為胰腺炎）為特征的疫病。至今，浙江、福建、上海、廣東、江西和廣西6省（市、自治區）的雛番鴨和雛半番鴨均有發生此病，對我國的養鴨業構成極大危害。經過一系列研究發現，該病病原屬于鴨1 型甲肝病毒。但胰腺炎型DHAV-1不能完全被經典的DHAV-1血清所中和[6]。這表明胰腺炎型DHAV-1 可能為DHAV-1 的亞型。

根據病毒抗原性的不同作為病毒分類的主要依據，特別是應用在劃分同種病毒的不同型及亞型過程中。因為病毒與抗血清之間的中和反應極其敏感，且具有嚴格的種、型特異性。因此，通常采用血清交叉中和試驗的方法判定不同毒株間的抗原關系[12]。毒株間親緣關系與交叉反應的程度呈正相關[5]。例如與鴨肝炎病毒同屬小RNA病毒的口蹄疫病毒利用血清交叉中和試驗計算不同毒株間的R 值，以區分鑒定血清型及亞型。本研究利用鴨胚交叉中和試驗測定了胰腺炎型DHAV-1 與經典的肝炎型DHAV-1 的交叉中和效價，計算得出胰腺炎型DHAV-1 與經典的肝炎型DHAV-1 的R 值，R 值的范圍處于（0.32，0.7）之間，這表明胰腺炎型DHAV-1 屬于鴨甲肝病毒的亞型（DHAV-1a）。因此本研究通過分析該病毒的抗原性明確了胰腺炎型DHAV-1 的分類地位，這為今后對該病毒進行深入的研究奠定基礎。

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