優化氣相色譜法測定小鼠血清和肝組織中脂肪酸的含量

李春艷，張秀英，張燕華，徐 尚

（東北農業大學動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱150030）

脂肪酸是脂質的重要組成元件，在各種組織中都表現出重要的生物學功能。研究表明，脂肪酸與胰島素抵抗、冠狀動脈疾病、高血壓、肥胖等慢性病密切相關[1]。在健康狀態下，機體組織中的脂肪酸處于相對平衡狀態，一旦機體患病，這種平衡將會打破，組織中的脂肪酸組成也將發生改變。因此，建立血清及肝組織中脂肪酸的定性、定量及快速檢測方法對醫學基礎研究及臨床檢驗均具有極其重要的意義，對血清與肝組織中脂肪酸譜的綜合分析也將有助于深入揭示不同脂肪酸間以及血清和肝組織脂肪酸變化間的相關性[2]。氣相色譜法是脂肪酸分析中最常用的方法，也是ISO 和AOCS 中所采用的方法。本試驗采用該方法測定小鼠血清和肝臟17 種脂肪酸的含量，為進一步闡明脂肪酸與疾病預防和治療的關系、尋找潛在的異常代謝途徑或致病機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 日本島津GC-14C 氣相色譜分析儀，氫火焰離子化檢測器（FID），色譜工作站（N3000），脂肪酸標準品和13%BF3-甲醇溶液，均購自Sigma 公司，氯仿和甲醇為色譜純。

1.2 標準溶液的配制 稱取每種脂肪酸標準品5 mg，分別置于5 mL 棕色容量瓶中，用正己烷溶解并定容，充分搖勻，配制成1 mg/mL 脂肪酸標準品的貯備液，吹入氮氣，密封，4 ℃保存。

1.3 色譜條件 毛細管色譜柱為DB-23（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent 公司）；載氣為氮氣（99.999%）：流速50 mL/min，氫氣：流速50 mL/min，空氣：流速500 mL/min；進樣1 μL；分流比為1∶30；進樣器溫度240 ℃；檢測器溫度260 ℃；柱溫程序升溫：初始柱溫50 ℃，保持2 min，升溫速率20 ℃/min，升到170 ℃保持1 min，2 ℃/min 升至240 ℃保持10 min。

1.4 樣品處理 樣品采集：健康雄性ICR 小鼠，眼球摘除采血，分離血清，并剖檢取出肝臟，保存于-80 ℃冰箱。樣品萃取：稱取肝臟組織100 mg，減碎置勻漿器中，加入1 mL 生理鹽水，冰浴中研磨成勻漿，加入三氯甲烷2 mL 甲醇1 mL[3]，充分混勻，共重復兩次，合并兩次提取液[4]，3 000 r/mim離心10 min，除去上層液相，下層有機相在氮氣流吹干，置-20 ℃冰箱中保存備用。血液樣本精確稱取100 μL，直接進行皂化衍生。皂化衍生：取出凍存提取物，加0.5 mol/LKOH-甲醇溶液1 mL，充氮氣密封，60 ℃水浴10 min，加13% BF3-甲醇1.5 mL，60 ℃水浴40 min，取出置冷，加入正己烷1.5 mL，渦流1 min 提取。加入飽和氯化鈉溶液2 mL，3 000 r/mim 離心15 min，靜置5 min，取上層液于螺口試管中，吹入氮氣，密封，4 ℃冰箱保存。1 μL 進樣進行氣相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制 脂肪酸標準儲備液用正己烷分別稀釋為8 個系列標準工作液，按照1.5 皂化衍生方法處理后進行分析，將相對應的脂肪酸標準品濃度y 和脂肪酸的色譜峰面積x 做線性回歸，其相應的回歸方程和相關系數如表1。

表1 脂肪酸的標準曲線和線性范圍

2.2 小鼠血清與肝組織中脂肪酸的檢測 圖譜如 圖1 所 示，出 峰 順 序 依 次 為C12、C14、C15、

C16、C17、C18、C18∶1、C18∶2、C18∶3、C20、C20∶1、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C22、C23、C22∶6，根據6次進樣確定脂肪酸標準品的保留時間進行定性（如表1 所示）。其中血清和肝臟樣本中飽和脂肪酸C20 及C23 僅在極少量樣本中有顯示，無法進行統計。

2.3 回收率及精密度 準確稱取小鼠肝臟100 μg 和血清100 μL，分別各自加入低、中、高3 個濃度的脂肪酸標準品溶液，按1.4 方法操作，每一濃度重復處理并進樣5 次，根據峰面積計算加標回收率和日內變異系數，連續測5 d，計算日間變異系數。結果如表2 和表3 所示。

2.4 靈敏度的測定 取空白血清和肝臟，按照1.4 中的樣品處理方法處理后，測得基線噪音值，分別按3 倍信噪比和10 倍信噪比獲得該方法的檢測限和定量限。結果如表1 所示。

圖1 氣相色譜

表2 血清中脂肪酸不同質量濃度的回收率和變異系數

表3 肝臟中脂肪酸不同質量濃度的回收率和變異系數

3 討論

3.1 色譜條件的選擇 本試驗所研究的脂肪酸種類多、范圍廣、沸點范圍較大，因此我們采用程序升溫和專門為分離脂肪酸甲酯而設計的強極性柱。程序升溫過程我們借鑒了Ma 等[5]的報道，并進行了優化。從色譜圖看，組織中的脂肪酸均得到了很好的分離。

3.2 樣品處理方法的優化 在預試驗中，我們對短期的冰凍組織和新鮮組織分別進行了脂肪酸含量的測定，發現二者差別不顯著，所以短期的冰凍對脂肪酸含量的測定沒有影響。

在肝臟組織前處理中，我們采用了經典的Floch 法，經過兩次抽提以減少脂質丟失。對甲酯化的溫度和時間進行研究，結果篩選出的脂肪酸甲酯化最佳條件是60 ℃和40 min，與Intorre 等[6]的衍生化條件較接近。在衍生化后，我們選擇提取層溶液直接進樣分析，而不是大多文獻[2]采用的氮氣吹干后復溶再進樣分析。前期我們通過對比發現經過氮氣吹干后再復溶會使一些脂肪酸的含量變低，可能是由于一些脂肪酸甲酯具有較高的揮發性。

3.3 方法學的驗證 在試驗條件下，組織中17 種脂肪酸的檢測限范圍是100 ng/mL～300 ng/mL。比國標[7]中報道的檢測限低。在高、中、低3 個添加濃度水平下，測得小鼠血清和肝臟回收率均大于80.72%，精密度小于5.74%。說明本方法測定組織中脂肪酸具有準確度好、重現性穩定、靈敏度高等優點，為脂肪酸含量檢測提供了簡便、快速、靈敏、準確的方法。

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[4] 姜文宇，方京沖，史虹莉.氣相色譜法測定血清脂肪酸組分[J].復旦學報（醫學版），2003，4：022.

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[7] 糧食部食品質量監督檢驗測試中心.GB/T 21676-2008 乳與乳制品脂肪酸的測定氣相色譜法[S].北京：中國標準出版社，2008.