泌乳奶牛銅缺乏與機體氧化應激的關系

許楚楚，劉健男，夏 成，張洪友，徐 闖

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶163319）

微量元素Cu 是維持奶牛機體正常新陳代謝的重要物質，在20 世紀初，Cu 就被認為是動物營養中必須的微量元素。Underwood 等報道，奶牛血漿Cu的正常含量為0.576～0.96 mg/L（9～15 mmol/L），當血漿中Cu 含量低于該值時視為缺乏[1]。

動物機體的抗氧化能力能反映機體對不良環境和疾病的抵抗能力。抗氧化體系中酶促反應體系主要包括一些酶，它們有超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，這些酶的活性中心是微量元素。總抗氧化能力（T-AOC）能反映動物體內兩套抗氧化體系總能力高低的指標，常常用于臨床生化檢驗[2]。銅藍蛋白（CP）是一種與免疫系統密切相關的銅蛋白，其作用為調節銅在機體各個部位的分布、合成含銅的酶蛋白，有著抗氧化劑的作用，并具有氧化酶活性，對多酚及多胺類底物有催化其氧化的能力[3]。當前，由于我國奶牛泌乳量的不斷提高，銅缺乏的亞臨床病例不斷增加，增高了機體對疾病的易感性，機體患病的風險明顯增大。因此，本試驗通過檢測泌乳奶牛微量元素Cu 和氧化應激指標的變化，不僅能闡明泌乳奶牛銅缺乏與機體氧化應激的關系，而且能探索銅缺乏的風險預警體系，為今后更有效的預防Cu 缺乏和提高機體抗氧化應激能力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 在黑龍江省某集約化規范化千頭牛場，泌乳奶牛采用散欄式飼養，TMR 全混日糧飼喂方式。選取體況相近（2.5～3.5），胎次相近（2～3 胎）的荷斯坦奶牛156 頭。試驗動物根據血漿Cu 水平，血漿Cu 含量小于9 mmol/L 為Cu 缺乏組，大于9 mmol/L 為Cu 正常牛。根據此標準將奶牛分為Cu 缺乏組26 頭，Cu 正常組130 頭。

1.2 樣品采集和分析 所有的試驗奶牛清晨空腹尾靜脈采集血樣10 mL，加肝素（20 μ/mL）抗凝，（3 500 r/min 離心10 min），分離血漿-80 ℃凍存。利用分光光度法測定血漿Cu 水平，Cu 試劑盒，購自南京建成生物工程公司；采用UNICO7200分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司提供）測定超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和銅藍蛋白（CP）等，它們的試劑盒，均購自南京建成生物工程公司。

試驗數據使用SPSS 19.0 進行統計分析。

2 結果

2.1 試驗牛血漿Cu 和氧化應激指標的比較 由表1 可知，Cu 缺乏組的CP 水平顯著低于Cu 正常組（P=0.000），Cu 缺乏組的T-AOC 水平顯著高于Cu 正常組（P=0.004）。Cu 缺乏組的SOD、GSH-Px水平和正常組無顯著差異（P=0.076，P=0.585）。

表1 試驗牛血漿C u和氧化應激指標的水平（平均數±SD）

2.2 試驗奶牛氧化指標與Cu 的相關性分析 由表2 可知，血漿中CP（R=0.049，P=0.00）與Cu 缺乏呈極顯著正相關，T-AOC（R=0.218，P=0.006）與Cu缺乏呈極顯著負相關，SOD（R=0.074，P=0.356）與Cu 缺乏無相關性，GSH-Px（R=-0.025，P=0.756）與Cu 缺乏無相關性。

2.3 試驗奶牛氧化應激指標對銅缺乏的預警作用 在表3 中列出了泌乳奶牛Cu 缺乏預警相關指標的分界值、敏感度和特異度及其各自的標準誤、陽性似然比和曲線下面積。通過計算Youden指數確定的最佳分界值和對應的敏感度和特異度。 由表3 和圖1 可知，各項氧化指標中CP 對Cu缺乏的診斷意義較大（AUC=0.709，P=0.001），臨界值為13.7U/L。

表2 奶牛抗氧化指標與C u缺乏的相關性

表3 氧化應激指標對C u缺乏診斷R O C 分析

3 討論

奶牛機體正常情況下，機體的抗氧化能力和源源不斷產生的氧自由基的氧化能力之間保持著一個動態的平衡關系，以確保機體組織免于氧化損傷。當抗氧化能力下降或者自由基產生異常增多的時候，將會導致組織的氧化損傷，從而促發許多疾病[4]。為防護氧自由基對生物膜的損傷，動物機體有著一套完善的抗氧化防御系統。按其性質可分為酶抗氧化系統和非酶抗氧化系統，酶抗氧化系統是有T-AOC、SOD、GSH-Px 等。非酶抗氧化系統中Cu、Mn、Zn、Se 是酶抗氧化指標的活性中心，直接影響這些酶的活性[5]。研究表明，Cu 在抗氧化作用方面，通過不同的方式發揮著重要的作用。當動物缺Cu 時，體內發生的各種病理或者生理變化與過氧化物的作用關系非常密切[6]。

本試驗中，T-AOC 與Cu 缺乏呈極顯著負相關（R=-0.218，P=0.006）。正常情況下，體內產生超氧陰離子自由基、過氧化氫等強氧化劑被抗氧化酶系及時清除。當Cu 缺乏時，抗氧化酶系活性降低，超氧陰離子自由基和過氧化氫積累，過量的超氧陰離子自由基使NO 氧化生成過氧硝酸鹽直接攻擊生物膜，發生脂質過氧化，使細胞膜結構和功能發生變化，流動性降低，導致細胞機能降低[7]。過量的過氧化氫使Cu2+形成Cu+O、Cu2+-OH攻擊酶臨近組氨酸殘基，使許多酶失活。過量的超氧陰離子自由基和過氧化氫還可使還原性谷胱甘肽氧化生成氧化型谷胱甘肽，從而反饋性抑制GSH-Px 的活性。當動物缺Cu 時，主要是通過大量活性氧改變免疫活性細胞的表面結構，從而導致組織內SOD 和GSH-Px 活性降低[8]。但本試驗中血漿中SOD 和GSH-Px 的含量和Cu 缺乏的關系不顯著。柴春彥[9]等研究表明，Cu 缺乏臨床組SOD 和GSH-Px 的含量和對照組差異明顯，但是亞臨床組SOD 和GSH-Px 的含量和對照組差異不顯著。本試驗的中SOD 和GSH-Px 的含量和Cu 缺乏關系不顯著原因可能與Cu 缺乏的程度有關。

CP作為一種抗氧化劑并且是組織中Cu的供體，不僅參與血漿Cu 的運輸，也可清除機體內的O2-自由基，CP 具有類似超氧化物歧化酶的作用[10]。本試驗中，血漿中CP（R=0.490，P=0.00）與血漿Cu 呈極顯著正相關。Kincaid 等[11]研究表明，血漿CP與血漿Cu的相關系數為0.50；何寶祥等[12]報道，育成奶牛血漿CP 與血漿Cu 的相關系數為0.92，相關系數均高于本試驗結果和Kincaid 等報道的結果。蔡永華等[13]報道，血漿CP 與血漿Cu 兩者的相關系數可達0.50或0.64 并且成正相關，當補Cu 后血漿Cu 恢復正常，相關性明顯降低，說明CP 活性與血漿Cu 密切相關，特別是血漿Cu 水平低時，相關性較高。王宗元和何寶祥都認為CP 測定有利于大范圍的調查，且可代替血漿Cu 的檢測[14]。本試驗在相關性分析中顯示CP可作為Cu 缺乏發生的風險因素（OR=1，P=0.012）。ROC 結果顯示CP 可作為Cu 缺乏預警指標（AUC=0.709，P=0.001），臨界值為13.7U/L。

綜上所述，本試驗中泌乳奶牛血漿中CP、TAOC 與銅缺乏密切相關，然而僅CP 可作為泌乳奶牛Cu 缺乏的風險預警指標。

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