遼寧豬圓環病毒病流行狀況調查與分析

顧貴波，于學武，譚立文，陳 瑤，魏 澍，趙 培，王 竹，魏園園，曹明慧

（1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽110164 ；2.大連市動物疫病預防控制中心，遼寧 大連116037；3.中國獸醫藥品監察所，北京 海淀100081）

1974 年，德國科學家Tischer 在多株連續傳代PK-15 細胞系（ATCC-CCL31）中發現豬圓環病毒（Porcine circovirus，PCV）。PCV 有PCV-1 和PCV-2兩個血清型，其中，PCV-2 感染可引起多種綜合征疫病，主要包括PMWS、PDNS、SAMS、PRDC[1]、CT[2]、壞死性淋巴腺炎及滲出性皮炎[3]等多種疾病，這些疾病被統稱為豬圓環病毒病（PCVD），或統稱為豬圓環病毒相關疾病（PCVAD）。

目前，PCVD 已在全球均有發生，給世界養豬業帶來的經濟損失巨大，自1991 年加拿大薩斯喀徹溫省首次報道本病以來，世界各地也相繼出現

了有關本病的報道，包括美國、法國、英國、西班牙、丹麥、瑞士、意大利、荷蘭、日本、韓國等二十多個國家；雖然全球眾多國家和地區都存在圓環病毒病，以及由PCV2 引發的相關疾病，但各地的流行態勢和毒株分布存在有較大差異[1]。郎洪武等[4]證實我國豬群PCV2 感染達42.9%以上。王忠田等[5]對從我國所分離的6 株PCV2 毒株的病毒核酸同源性均在95%以上，與歐美毒株同源性為94.4%～99.7%。我們應用現代分子生物學技術，對在遼寧省豬群PCV2 的流行情況及基因遺傳演化進行調查分析，為遼寧地區豬群PCVD 診斷、綜合防制及研究提供重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 DNA Marker DL-2 000、E.coli JM109 感受態菌等為寶生物工程（大連）有限公司產品。豬圓環病毒Ⅱ型熒光PCR 檢測試劑盒（TaqMan 探針法）為北京生科尚儀科技有限公司產品。

1.2 遼寧豬群PCV-2 流行情況調查 對遼寧14個地區的門診、屠宰場，針對PCV-2 進行流行病學調查，采集相應的組織病料，低溫冷藏條件下，快速運送至實驗室，用于PCV-2 核酸檢測。

1.3 PCV-2 全基因序列擴增與分析 參照文獻[6]建立的PCV-2 全基因序列PCR 擴增方法，選取PCV-2 陽性樣品擴增其全基因序列，檢測PCR 產物，純化的PCR 產物與pMD-18T Vector 連接，然后轉化E.coli JM109 感受態細胞，經PCR 鑒定后，送寶生物工程（大連）有限公司測定其核苷酸序列。應用DNAStar 軟件對測定的序列與GenBank中收錄來自歐洲、美洲、亞洲以及中國的具有代表性毒株序列進行同源性與進化分析。引物序列及擴增片斷大小見表1。

表1 引物序列及其擴增片斷

PCR 反應體系為50 μL，體系組成如下：2×GC BufferⅠ25.0 μL、滅菌ddH2O 10.5 μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）8.0 μL、LA Taq（5U/μL）0.5 μL、PCV-2 QC-F（20 μmol/L）1.0 μL、PCV-2 QC-R（20 μmol/L）1.0 μL、DNA 4.0 μL。

反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1min，共35 個循環；72 ℃終延伸10 min。取5 μL PCR 產物用于電泳檢測。1.4 數據處理 采用SSPS17.0 處理數據，做卡方檢驗及F 檢驗，分析組間差異。

2 結果與分析

2.1 遼寧豬群PCV2 流行情況

2.1.1 臨床發病豬群組織樣品PCV-2 核酸檢測結果 2008-2012 年對來自遼寧地區3336 份門診病例豬組織樣品進行PCV-2 核酸檢測，平均陽性率為58.99%，分別對不同年度、地域及全省總體陽性率情況進行卡方檢驗分析，不同年度間全省、遼中、遼北及遼東地區均無統計學差異（P＞0.05），而遼南、遼西地區漸近性差異顯著（P=0.028；P=0.006）；2008-2012 年各年度不同地域間均無統計學差異（P＞0.05）（表2）。

2.1.2 臨床健康豬群組織樣品PCV-2 核酸檢測結果

2010-2013 年采自屠宰場的930 份豬組織樣品進行核酸檢測，總體陽性率為64.07%；其中，2010-2013年核酸陽性率分別為44.29%、55.11%、72.80%和85.67%（表3）；呈逐年上升趨勢，統計分析表明，各年度核酸陽性率漸近性差異顯著（P=0.014）。

表2 不同地區臨床發病豬組織病料PC V-2核酸檢測陽性率

表3 臨床健康豬組織樣品PC V-2核酸檢測陽性率

2.2 PCV-2 全基因組的擴增與序列測定分析

2.2.1 PCV-2 全基因組的擴增與序列測定 應用擴增PCV-2 全基因序列的PCR 引物，分別從組織病料和細胞培養物中擴增到位于2 000 bp 附近特異條帶，與預期大小相符（圖1）。應用病毒分離鑒定和PCR 擴增方法，最終得到11 株遼寧毒株（以下簡稱LN-PCV-2 毒株）的全基因序列，其中2012 年6 株，2013 年5 株（表4）；測序結果表明，其長度為1 767 或1 768 bp。

圖1 LN-PC V-2毒株全基因序列擴增結果

表4 2012年和2013年LN-PC V-2毒株

2.2.2 PCV-2 全基因組序列分析 應用DNAStar軟件，將11 株LN-PCV-2 毒株全基因序列同選自GenBank 中收錄來自歐洲、美洲、亞洲以及中國的具有代表性的19 株PCV-2 毒株（國外11 株，國內8 株）進行同源性與進化分析。結果表明，11 株LN-PCV-2 毒株之間同源性為94.5%～99.4%；2012 年6 株LN-PCV-2 毒株間同源性為95.4%～99.4%，2013 年5 株LN-PCV-2 毒株間同源性為95.2%～99.3%；遼東地區2 株間同源性為98.2%，遼南地區2 株間同源性為95.9%，遼西地區2 株間同源性為96%，遼北地區3 株間同源性為95.7%、95.1%和98.5%，遼中地區2 株間同源性為95.1%。

與國內毒株相比，與處于同一地理區域的東北PCV-2 毒株同源性為95.3%～99.4%；與毗鄰的華北地區PCV2 毒株間同源性為94.6%～99.6%；與華東、華南、華中、西北和西南PCV2 毒株間同源性分別為94.8%～99.7%、95.2%～99.3%、94.5%～96.5%、94.6%～99.5%和94.8%～99.4%。

與國外PCV-2 毒株間同源性為94.3%～99.3%，其中，與歐洲PCV-2 毒株間同源性為95%～98.4%，與美洲PCV-2 毒株間同源性為94.3%～99.3%，與同處于亞洲朝鮮半島PCV-2 毒株間同源性為94.5%～96.6%；在國外毒株中，與法國PCV-2 毒株同源性相對較高（95.4%～99.3%），而與加拿大的PCV-2 毒株同源性相對較低（94.3%～97%）。

根據Olvera 等[7]分型標準，11 株LN-PCV-2 毒株中有9株屬于PCV-2b基因型，其中屬1A/1B亞群（型）7 株，1C亞群（型）2 株；另2 株屬于PCV-2a 基因型。按年度分布，2012 年6 株PCV-2 毒株中，PCV-2b 基因型1A/1B 亞群4 株，另2 株為PCV-2a 基因型；2013年5 株PCV-2 毒株中，PCV-2b 基因型1A/1B 亞群3株，PCV-2b 基因型1C 亞群2 株。按地域分布，遼東地區2 株，均屬于PCV-2b 基因型1A/1B 亞群；遼南地區2 株，分別屬于PCV-2b 基因型1A/1B 亞群和1C亞群；遼西地區2 株，分別屬于PCV-2b 基因型1A/1B亞群和1C 亞群；遼北地區3 株，PCV-2b 基因型1A/1B 亞群2 株，PCV-2a 基因型1 株，遼中地區2 株，分別屬于PCV-2b基因型1A/1B亞群和PCV-2a基因型。

3 討論

3.1 英國于1993 年首次暴發由PCV-2 感染引起的PDNS，自1999 年后，PMWS 在英國呈上升 趨勢，平均發病率為25%，而最高可達40%，由其造成的經濟損失比豬瘟和口蹄疫還要大[8]。張志等[9]調查表明，國內豬群PCV-2 感染率逐年攀升，最高達90%以上，屠宰場采集的組織樣品也高達60%。通過對遼寧省臨床發病和臨床健康豬群的組織樣品進行檢測，平均陽性率分別為58.99%和53.81%，且呈逐年上升趨勢，表明在遼寧地區豬群中普遍存在PCV-2 感染，污染面逐年擴大。分析比對臨床發病豬群與臨床健康豬群檢測結果發現，臨床健康豬群PCV-2 陽性率與臨床發病豬群相當，進一步證實了PCV-2 有隱性感染的特點，遼寧地區臨床健康豬群中有大量的PCV-2 隱性感染或/和亞臨床感染豬，應引起足夠的重視。

3.2 全基因序列同源性分析表明，不同年度、不同地域毒株全基因序列的同源性較高，表明近2年來遼寧流行的PCV-2 毒株沒有明顯的空間和時間特征，而且，至少存在3 個亞型，PCV-2b 為主要流行基因型；同一時期遼寧豬群中存在著不同進化階段的PCV-2 毒株流行，與文獻報道的國內其他地區情況也基本一致[10]。11 株LN-PCV-2 毒株與國內、外PCV-2 毒株變異程度均不大，表明PCV-2 流行毒株沒有地域意義。由基于全基因序列的系統進化樹可知，11 株LN-PCV-2 毒株散布于兩大基因型中，其分散程度與19 株國內外PCV-2 參考毒株相當，表明國內PCV-2 毒株來源可能較廣泛，一些可能由美國、加拿大等國傳入；另一部分可能源于歐洲，但這一觀點還需通過分析更多PCV-2 毒株序列進一步證實；同時，也表明遼寧豬群中PCV-2 流行情況比較復雜。

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