雞傳染性貧血病毒vp3 基因在真核細胞中的表達與功能分析

黃超華，張全紅，陳 坤，王永強，曹 紅，李曉齊，鄭世軍

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀100193 ；2.蛇口出入境檢驗檢疫局，廣東 深圳518054；3.國家知識產權局專利局專利審查協作北京中心，北京 海淀100190）

雞傳染性貧血病毒（CIAV）作為雞傳染性貧血（CIA）的病原，主要引起感染雞再生障礙性貧血和雛雞的免疫抑制，繼而引發其他病原發生繼發感染。該病毒在世界范圍內廣泛分布，對養雞業是一種潛在的巨大威脅。

雞傳染性貧血病毒（CIAV）屬于圓環病毒科。Noteborn 等人于1991 年對CIAV 的全基因組進行了分析，發現其長度為2.3 kb，含3 個開放閱讀框架（ORF），分別編碼VP1、VP2、VP3 等3 種病毒蛋白[1]。VP3 作為CIAV 的非結構蛋白，是CIAV最主要的致病因子，能夠誘導感染雛雞骨髓造血細胞及胸腺的前T 細胞凋亡[2]，從而導致雛雞出現嚴重的出血、貧血及免疫抑制。同時，研究證實，VP3 能選擇性地誘導人轉化細胞和腫瘤細胞凋亡，而對正常二倍體細胞無毒害作用[3]。因為這種特性，VP3 成為抗腫瘤藥物的研究熱點，被命名為“Apoptin”。研究表明，VP3 誘導的腫瘤細胞凋亡不需要腫瘤抑制因子p53 的介導[4]，但依賴于caspase 的參與，尤其是caspase-3 的活化[5]。除此之外，人們通過各種技術手段找到了一些可能參與Apoptin 凋亡過程的蛋白，如孫敬國[6]等發現，ABP280、NMI、UPH 和MYB 等 結 合 蛋 白 可 以 與Apoptin 結合；Cheng[7]等也篩選到了幾種與Apoptin相互作用的蛋白，其中包括APAPI 和Hippi 等。這些蛋白都可能參與了Apoptin 誘導的細胞凋亡過程。但是，Apoptin 誘導細胞凋亡的具體途徑仍不清楚，需要進一步的研究。本研究成功克隆到CIAV vp3 基因并成功構建出真核表達載體pEGFP-VP3。后者可以在293 T 和BHK-21 細胞中瞬時表達VP3 蛋白，并能誘導細胞死亡，為深入研究CIAV 的致病機理奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 CIAV 病毒毒株與細胞 CIAV 病毒Cux-1 標準株由北京市農林科學院楊兵副研究員提供，293 T 和BHK-21 細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 Taq plus DNA 聚合酶、質粒小量提取試劑盒、DNA 回收試劑盒，購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；感受態細胞E.coli DH5α、DNA Marker，購自北京天為時代生物公司；限制性內切酶、pMD18-T simple 連接試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；X-gal、IPTG 為Sigma 公司產品；質粒大量提取試劑盒、真核細胞轉染試劑盒和化學發光檢測試劑盒，購自北京威格拉斯公司；真核表達載體pEGFP-N1 由本實驗室保存。

此外，就該詩來說，華茲華斯并未滿足于母國曾對蘇格蘭的殖民壓迫，他甚至認為未來還有同樣的事情發生。這不僅表明詩人對日不落帝國可以永遠保持主體地位的渴望，同時也暗含其對蘇格蘭永恒他者地位的期許。無獨有偶，詩人的帝國憧憬在《紫杉樹》中也有較好的展示：

1.6 重組真核表達載體pEGFP-vp3 的構建 將篩選出的上述陽性重組質粒和真核表達載體pEGFP-N1 分別用Xho I 和BamH I 進行雙酶切，電泳回收和純化DNA 片段后進行連接和轉化，篩選陽性菌落，并進行酶切和PCR 鑒定。

以pCMV-Myc-vp3 轉染293 細胞24 h 收獲細胞蛋白，進行Western Blot 檢測。HSC70 蛋白作為細胞的內參對照蛋白。

此 外，以pCMV-Myc-vp3 轉 染293 T 細 胞 后24 h，VP3-Myc 融合蛋白明顯表達（圖4），進一步證實VP3 在細胞中成功表達。

1.3 引物設計 參考GenBank 中CIAV 病毒Cux-1標準株的基因組序列，應用Primer5.0軟件設計引物，分別在上下游引物中加入Xho I 和BamH I 兩個酶切位點，預期擴增長度為377 bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。上游引物：5′-CTC GAG ATC TCA AAT GAA CGC TC-3′；下游引物：5′-GGA TCC CGC AGT CTT ATA CGC C-3′。

連接鍋爐至文丘里冷卻器[3]（可利用原惰氣系統輔助冷卻器，需核算換熱量是否滿足）工藝管路。改在完成后，鍋爐產生尾氣，進入冷卻器冷卻，通過增壓風機增壓后進入大艙做為覆蓋氣。增加兩路電動控制閥用于在熱介質鍋爐尾氣流程下游發生故障時進行閥門切換，以保證鍋爐尾氣可以順利排放至大氣，穩定鍋爐運行。具體工藝如圖1。

1.7 重組真核表達質粒pEGFP-vp3 在真核細胞中的瞬時表達 將鑒定為陽性的質粒，進行擴大培養，并根據質粒提取試劑盒的說明，大量提取重組真核表達質粒pEGFP-vp3。隨后，按照真核細胞轉染試劑盒提供的步驟將重組真核表達質粒pEGFP-vp3 轉染BHK-21 和293T 細胞中。轉染24 h 后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光；同時提取細胞總RNA，進行RT-PCR。從而確定重組真核表達質粒pEGFP-vp3 的瞬時表達情況。在pCMV-Myc-vp3 轉染細胞24 h 后，收取細胞通過常規Western Blot，檢測VP3 蛋白表達情況，HSC 70作為內參考對照細胞蛋白。

2.2 pEGFP-vp3 瞬時表達的RT-PCR 結果 轉染后24 h，提取轉染細胞的總RNA，并進行RTPCR。從結果可以看到均能從轉染pEGFP-vp3 的293T 細胞和BHK-21 細胞的RNA 中擴增出特異的DNA 條帶，大小為377 bp 左右，與預期的VP3基因一致（見圖2）。其中198 bp β-actin 為參照。這說明轉染了pEGFP-vp3 的293T 細胞和BHK-21細胞均能轉錄出vp3 的mRNA。

2 結果

2.1 CIAV vp3 基因的擴增和克隆與真核表達載體的構建 以提取的CIAV DNA 為模板，利用CIAV vp3 特異引物進行PCR 擴增，其產物經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示大小約為377 bp，與預期大小一致（見圖1 A）。將vp3 PCR 產物插入克隆載體pMD18-T simple vector，并對重組克隆質粒pMD-vp3 進行PCR 和酶切鑒定和測序，發現與GenBank 發表的雞傳染性貧血病毒Cux-1 標準株的vp3 基因同源性在99.8%以上，說明克隆片段為vp3 基因序列。將提取的重組真核表達質粒pEGFP-vp3 進行PCR 和酶切鑒定：擴增出4 700 bp 和377 bp 的兩條帶（見圖1B）。結果表明，目的片段vp3 基因已成功地插入到真核表達載體pEGFPN1 上。同樣，pCMV-Myc-vp3 也構建成功。

圖1 vp3基因的克隆和真核表達載體pEG FP-vp3的構建

1.8 臺盼藍染色實試驗 采用臺盼藍染色法檢測細胞活力。設計3 組實驗，分別為空白對照組（control 組）、空載體對照組（pEGFP-N1 組）和pEGFP-vp3 組。分別于轉染后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 收集293T 細胞，并制備成密度為105個/mL 的細胞懸液，1∶1 加入0.4%臺盼藍染色液，作用3 min，立即在普通光學顯微鏡下用血細胞計數板進行細胞計數。細胞核藍染的，為死亡細胞，結果以細胞死亡率（細胞死亡率=死亡細胞數/死亡細胞+活細胞數）表示。結果組間差異用t-檢驗進行統計學分析，P＜0.05 為差異顯著。

圖2 pEG FP-vp3瞬時表達的R T-PC R 結果

2.3 pEGFP-vp3 瞬時表達的熒光觀察以及Western Blot 檢測 轉染24 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。結果顯示，轉染pEGFP-vp3 的293T細胞和BHK-21 細胞均能產生清晰的熒光。將轉染了pEGFP-vp3 的細胞與轉染了pEGFP-N1 空載體的細胞進行比較，可以發現轉染pEGFP-vp3 的細胞的熒光聚集成顆粒狀且固定在一定區域，而后者的熒光則彌散在整個細胞的細胞質和細胞核中（見圖3）。這可能與VP3 蛋白的特性相關，在細胞中表達的VP3 蛋白常常以細小的顆粒存在，有時還形成相對較大的球狀顆粒。這說明真核表達載體pEGFP-vp3 可以表達融合綠色熒光蛋白的VP3 蛋白。

圖3 pEG FP-vp3瞬時表達的熒光觀察結果 （200×）

1.5 擴增產物的克隆和測序 按照連接試劑盒說明書，將回收PCR 產物與pMD18-T simple vector 進行連接，1 h 后轉化感受態E.coli.DH5α，涂布于含氨芐青霉素（100 IU/mL）和X-gal IPTG 的LB培養板，于37 ℃培養過夜，挑取白色菌落后過夜培養，提取質粒，將酶切和PCR 鑒定為陽性的重組質粒進行序列測定。

2.3 不同分期的宮頸癌組織中Ki-67、p16及p53表達情況的比較 16例宮頸癌患者中，Ⅰ期10例，Ⅱ期6例。宮頸癌Ⅰ期與Ⅱ期患者Ki-67、p16及p53表達陽性率的比較，存在明顯差異(P<0.05)。見表3。

圖4 W esternBlot檢測VP3-myc融合蛋白表達

1.4 CIAV vp3 基因的PCR 擴增 以提取的CIAV基因組DNA 為模板，利用上述引物擴增CIAV vp3基因。反應總體積為50 μL，其中上下游引物各0.5 μmol/L，dNTP 為0.2 mmol/L，模板100 ng，Taq plus 酶1 U，10×反應緩沖液5 μL，加滅菌三蒸水補足至50 μL。反應程序：95 ℃4 min，94 ℃45 s，57 ℃50 s，72 ℃1 min，循環30 次，72 ℃延伸10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA 回收試劑盒回收和純化。

2.4 VP3 蛋白對細胞活性的影響 為了確定VP3蛋白是否仍具有凋亡功能，將pEGFP-vp3 轉染至293T 細胞中，觀察其對293T 細胞活性的影響。結果顯示，與空白對照組和空載體轉染對照組(pEGFP-N1 組)比較，轉染后64 h、96 h、120 h 的細胞凋亡率分別為9.47%、13.17%和14.23%（見圖5）。與對照組相比，pEGFP-vp3 轉染組的細胞凋亡現象明顯（P＜0.05）。

南京體育學院民間體育課程的教學目標不是很明確，對于培養出什么樣的專業人才還是很模糊，在課程大綱的設定中沒有自己的特色，課時的分配還算合理，但不能滿足學生的需求。

圖5 VP3誘導細胞死亡作用

3 討論

CIAV VP3 蛋白，即“凋亡素”（Apoptin），被認為是真正意義上可以選擇性誘導腫瘤細胞凋亡、而不損傷正常細胞的蛋白之一，有可能發展成為一種很有前途的腫瘤基因治療藥物。這種獨特的選擇性凋亡效應，與VP3 蛋白在細胞中的定位存在一定聯系。VP3 蛋白表達后迅速進入腫瘤或轉化細胞的細胞核內，而一直只存在于正常細胞的細胞質內[8]。這種選擇性的細胞定位與VP3 蛋白C 端的兩個核定位信號（NLS1 和NLS2）密切相關，同時也與VP3 蛋白第108 位的蘇氨酸殘基（T108）的磷酸化相關[9]。即在腫瘤細胞中，VP3 蛋白的T108 處于磷酸化狀態；而在正常細胞中，VP3 蛋白的T108 氨基酸處于去磷酸化狀態。去掉VP3 蛋白中的核運輸信號或者突變T108 氨基酸都會影響VP3 的凋亡作用，甚至使其喪失凋亡作用。本研究成功克隆到CIAV vp3 基因，并與GenBank 中 提 供Cux-1 株 的vp3 序 列 比 對，發 現VP3 在堿基水平只發生了一個堿基的突變，并沒有造成其氨基酸水平的突變，也就是說VP3 蛋白中對其凋亡作用起關鍵作用的區域和位點都未發生突變，說明VP3 蛋白仍可能具有其原有的凋亡功能。臺盼藍染色試驗進一步證實VP3 蛋白仍具有一定的凋亡功能。

2) 跨站防誤閉鎖：實現變電站與變電站之間的閉鎖功能，杜絕多變電站同時操作時，線路帶電情況下合出線側接地刀閘的安全隱患。

VP3 蛋白誘導腫瘤細胞凋亡的過程不需要p35 的介導，同時也不會因Bcl-2 的過量表達而受到抑制，因此可以誘導p35 缺失的腫瘤細胞凋亡，其應用前景廣泛。目前，研究者發現VP3 選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡涉及到眾多蛋白，但其具體通路仍不清楚。本研究成功構建表達雞傳染性貧血病毒vp3 基因的真核表達載體pEGFP-vp3，將該載體轉染至真核細胞中可以表達與綠色熒光蛋白（GFP）融合表達的VP3 蛋白，因此可以進一步研究VP3 的細胞定位與VP3 的凋亡效應之間的關系，并且也有利于研究VP3 與細胞凋亡相關蛋白之間的關系。為進一步研究VP3 的功能奠定了良好的基礎。

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