嘔吐毒素對斷奶仔豬外周血液中C D 4+、C D 8+淋巴細胞及抗氧化水平的影響

姬長云，程漢奎，張靜潔，鄧 超，鐘佳蓮，李維鋮，鄧銜柏

（華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又稱作嘔吐毒素（vomitoxin，VT），屬于單端孢霉烯族化合物，是全世界飼料和糧食污染的主要真菌毒素之一[1-2]。隨著對嘔吐毒素的深入研究，發現DON 對動物和人都會產生免疫抑制作用。它可劑量依賴地誘導并促進小鼠胸腺細胞的凋亡和抑制其增殖，從而對小鼠的免疫功能產生一定的負面影響[3-4]。還可以影響小鼠腸黏膜的生理屏障功能，干擾機體蛋白質的合成，造成免疫系統抑制等[5]。

在動物免疫學研究中，經常需要了解外周血中淋巴細胞的分類及含量情況。根據來源和功能的不同，淋巴細胞可分為T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、NK 細胞等幾大類[6]，T 細胞又分為CD4+、CD8+細胞亞群。CD4+細胞協助B 淋巴細胞產生抗體，CD8+和CD4+能通過清除體內被病毒感染的細胞或分泌具有抗病毒特性的細胞因子產生保護性免疫[7]。且CD4+/CD8+的比值可反映動物體疾病的發展歷程,所以準確地測定外周血中CD4+、CD8+細胞數量就顯得尤其重要[8]。正常生理狀態下，機體氧自由基的生成（氧化系統）和清除（抗氧化系統）存在一種動態平衡。病理因素和外源有毒有害物質會打破這種平衡，使自由基積累，造成機體氧化功能損傷。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）是機體抗氧化系統的重要組成部分，在清除體內氧自由基，緩解氧化損傷方面發揮著重要作用。

本試驗通過研究嘔吐毒素對仔豬外周血液中CD4+、CD8+淋巴細胞亞群及血清中CAT、GSH-Px、SOD、MDA 活性的影響，揭示了實際生產中斷奶仔豬在誤食霉變飼料后，機體的細胞免疫及抗氧化功能遭受損傷所經歷的過程，便于豬只在中毒前期未表現中毒癥狀時就提早采取措施，防治疾病的發生，也為實驗室診斷和建立豬場健康體檢系統提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 DON污染飼糧的準備 準確稱取一定量的DON標準品（Sigma 公司，批號：097K4010），溶解于適量生理鹽水中配成一定濃度的溶液。將基礎飼糧平鋪于地面上，厚度適中，然后將配制好的DON 溶液噴灑于基礎飼糧上，攪拌，混勻。處理過程中保持底物含水量均勻且在20%左右，溫度約28 ℃，處理7 d。將處理好的飼糧與未處理的基礎飼糧按1∶1混合均勻。本試驗周期為38 d，先后共處理飼料5次，每次每組取樣2 份裝入潔凈的密閉塑料袋，標記，-20 ℃保存，用于測定DON 含量（處理后的飼糧中DON 濃度為2 mg/kg）。

1.2 試驗設計 10 頭25 日齡平均體重為（7.70±1.00）kg 的杜×大×長三元雜交斷奶仔豬，打耳號，做好標記，隨機分為兩組，分別進行基礎飼糧飼喂（對照組）、基礎飼糧+DON 飼喂（試驗組）。試驗前適應性飼養7 d，正式試驗期為38 d。仔豬在同一豬舍內飼養，自由采食和飲水，每天飼喂2 次（早上8:00 和下午17:00）、清圈2 次，觀察仔豬采食和健康狀況。分別在試驗第0、8、16、24 天采血檢測CD4+、CD8+淋巴細胞水平，在0、16、24、36 天采血檢測血清CAT、GSH-Px、SOD、MDA 的活性。

1.3 淋巴細胞亞群的測定 （1）取2 mL 新鮮抗凝血，與中性PBS 1∶1 混勻后慢慢加人等體積本分離液之液面上；（2）以400 g（約1 500 r/min）離心（水平轉子）15 min。此時離心管中由上至下細胞分4 層。第1 層為血漿層，第2 層為環狀乳白色淋巴細胞層，第3 層為透明的分離液層，第四層為紅細胞層。收集第二層細胞放入含中性PBS 洗滌液1mL 的試管中，充分混勻后，以500 g 約（1 800 r/min）離心20 min，棄去上清留沉淀細胞重新懸起，重復洗滌2 次即得所需淋巴細胞，所有操作均按試劑盒說明書進行。用流式細胞儀檢測淋巴細胞（美國BD 公司，FACS420 型）。

1.4 血清CAT、GSH-Px、SOD、MDA 活性的測定

分別在試驗第0、16、24、36 天頸靜脈采血，靜置30 min，離心，保留血清用來檢測抗氧化指標。所用試劑盒為南京建成生物工程研究所測指標分別為谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px），過氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MAD）的活性，所有指標均按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計分析 試驗數據采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析和Duncan 氏法進行各組間多重比較，以P＜0.05 作為差異性顯著判斷標準。試驗數據以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 CD4+、CD8+淋巴細胞亞群檢測結果 由表1和圖1 可知，與對照組相比DON 組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+無明顯變化，差異性不顯著。且試驗組和對照組數據變化趨勢基本一致。

表1 淋巴細胞檢測結果

2.2 血清CAT、GSH-Px、SOD、MDA 由表2 可見，與對照組相比，在試驗第24 天和36 天SOD 的活性顯著降低，差異極顯著（P＜0.01）；在試驗第16 天MDA 的活性顯著降低，差異顯著（P＜0.05）；在試驗第16 天CAT 活性顯著降低，差異顯著（P＜0.05），第24、36 天MDA 差異極顯著（P＜0.01）；在試驗第24、36 天，GSH-Px 活性顯著降低。隨著時間的增加試驗組和對照組的SOD 活性逐漸降低，MDA 活性逐漸升高；CAT 指標變化為對照組先降低在第36 天升高，試驗組為逐漸降低；GSH-Px 指標變化為對照組和試驗組都在第24 天升高然后又降低。

3 結論與討論

3.1 DON 對CD4+、CD8+淋巴細胞的影響 T 淋巴細胞是外周血液中的主要淋巴細胞（約占80%～90%），是機體發揮細胞免疫和免疫調節作用的主要成分，并能對B 淋巴細胞分泌免疫球蛋白的過程進行調控。 T 細胞具有多種生物學功能，如直接殺傷靶細胞，輔助或抑制B 細胞產生抗體，對特異性抗原和促有絲分裂原的應答反應以及產生細胞因子等都能起到一定的作用[9-10]。成熟的T 淋巴細胞表面均可表達CD3+分子，而CD4+、CD8+分子不能同時表達于同一成熟的T 淋巴細胞表面，故可將成熟的T 淋巴細胞分為CD4+淋巴細胞和CD8+淋巴細胞兩個亞群。這兩種細胞對免疫反應和維持免疫穩定起重要作用，機體細胞免疫功能正常時，CD4+/CD8+處于恒定范圍，若其平衡失調，則會導致機體免疫功能紊亂，產生一系列免疫病理變化，影響機體的免疫保護機制，引起一系列免疫缺陷疾病或自身免疫病[11-12]，CD4+/CD8+比值降低是疾病程度變重的主要標志之一[13]，也提示患者機體處于免疫抑制狀態[14]。實驗室可通過檢測CD4+、CD8+淋巴細胞亞群的百分率和CD4+/CD8+比值作為評價機體免疫狀況高低的依據。本試驗結果顯示，試驗組與對照組相比，CD4+、CD8+淋巴細胞亞群的百分率以及CD4+/CD8+比值未出現明顯差異，但數值較正常的比值要低，說明試驗組對斷奶仔豬的淋巴細胞平衡產生一定的影響但不明顯，可能是DON 含量劑量低，仔豬的免疫系統對DON 有一定的耐受性。試驗揭示了低劑量DON 對仔豬外周血液中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的平衡影響非常小，在感染毒素時間不久的情況下對仔豬的外周免疫系統產生較小的毒害作用。

表2 酶活性檢測結果

圖1 淋巴細胞檢測結果

3.2 DON 對血清中CAT、GSH-Px、SOD、MDA 的影響 CAT、GSH-Px、SOD、MDA 都是反應機體抗氧化水平的重要指標，正常生理狀態下，機體氧自由基的生成（氧化系統）和清除（抗氧化系統）存在一種動態平衡。病理因素和外源有毒有害物質會打破這種平衡，使自由基積累,造成機體氧化損傷。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）是機體抗氧化系統的重要組成部分，在清除體內氧自由基，緩解氧化損傷方面發揮著重要作用。飼糧中添加自然霉變玉米可以降低大鼠機體抗氧化能力并損傷大鼠肝功能，其效應隨飼糧中霉變玉米比例的增加而增強[15]。本次試驗結果為CDA、GSH-Px、SOD、MDA 均有明顯下降，可能由于長期的暴露在DON下，機體處于失代償狀態，與付瑩等[16]研究的基本一致，縱使DON 含量較低，但影響代償時間較長，也會對機體造成一定程度的損傷。且對各種指標的變化規律產生了一定影響。

3.3 結論 本研究表明，低劑量（2 mg/kg）DON 污染的飼糧雖然未明顯影響斷奶仔豬CD4+、CD8+淋巴細胞亞群的平衡，但是對仔豬機體的抗氧化水平造成了一定程度的損害，說明DON 在影響機體健康時，先是從破壞機體抗氧化系統開始的。

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