寧夏地區(qū)雞源耐藥性大腸桿菌Ⅰ類整合子的研究

楊 聰，周學(xué)章，杜 軍，劉成敏，2

（1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川750021；2.寧夏大學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化中心，寧夏 銀川750021）

細(xì)菌對抗生素耐藥和多重耐藥已成為全球關(guān)注的問題。目前認(rèn)為整合子-基因盒系統(tǒng)，是細(xì)菌多重耐藥快速發(fā)展的一個不容忽視的原因。細(xì)菌通過整合子系統(tǒng),在整合酶作用下，捕獲外來耐藥基因,并在啟動子作用下得到表達，使細(xì)菌具有耐藥及多重耐藥性[1]。目前大腸桿菌Ⅰ類整合子研究較多，但對雞源大腸桿菌的研究相對較少。以寧夏某地區(qū)的30株臨床分離的雞源大腸桿菌為研究對象，對其耐藥情況、整合子分布及其結(jié)構(gòu)特征等進行研究，為指導(dǎo)臨床合理使用抗生素，控制耐藥菌株在禽類間的傳播提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 寧夏地區(qū)臨床分離雞源大腸桿菌30株，質(zhì)控菌株為大腸桿菌ATCC25922。

1.2 試劑 Taq DNA聚合酶，2 kb DNAMarke，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。藥敏紙片共12種：阿莫西林（AMO，10μg/片）、青霉素G（PEN，10μg/片）、頭孢噻肟（CTX，30μg/片）、頭孢曲松（CRO，30 μg/片）、卡那霉素（KAN，30μg/片）、慶大霉素（GEN，10μg/片）、氯霉素（CHL，30μg/片）、環(huán)丙沙星（CIP，5μg/片）、氧氟沙星（OFL，20μg/片）；四環(huán)素（TET，30μg/片）、林可霉素（LIN，15μg/片）、磺胺甲氧嘧啶（SMD，5μg/片）。

1.3 藥敏試驗 按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）推薦的紙片擴散法進行操作和結(jié)果判定。

1.4 引物序列 根據(jù)GenBank收錄的Ⅰ類整合子的序列，參考吳聰明等設(shè)計擴增Ⅰ類整合酶基因（Int1Ⅰ）、可變區(qū)（基因盒）的引物，引物序列見表1。

表1 Ⅰ類整合子的PCR擴增引物序列

1.5 Ⅰ類整合子的檢測

1.5.1 Ⅰ類整合酶基因的檢測 用煮沸裂解法提取模版DNA；PCR反應(yīng)體系為25μL：上、下游引物個0.5μL（10μmol/L）;模版DNA 2μL；2×Trans Taq PCRmix 12.5μL；最后加ddH2O至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，57.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴增30個循環(huán)；72℃后延伸10min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.2 Ⅰ類整合子基因盒插入?yún)^(qū)的檢測 基因盒插入?yún)^(qū)的檢測采用降落PCR（TD-PCR）方法，以提高PCR反應(yīng)的特異性，反應(yīng)體系為：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，65.5℃退火30 s，72℃延伸2min，2個循環(huán)；以后每2個循環(huán)退火溫度降低1℃，退火溫度從65.5℃降落到56.5℃；94℃變性30 s，56.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，12個循環(huán)；72℃后延伸10min，4℃保溫。取適量擴增產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照分析。

1.6 整合子可變區(qū)擴增產(chǎn)物測序 將Ⅰ類整合子基因盒的PCR產(chǎn)物經(jīng)JET quick PCR Product purificationkit純化后進行DNA測序（北京生物工程公司完成），結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中采用BLAST軟件進行同源性分析。

1.7 統(tǒng)計方法 根據(jù)Ⅰ類整合酶基因的檢測結(jié)果，將大腸桿菌分為整合子陽性組和陰性組。采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對整合子陽性組和陰性組的藥敏情況進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 對藥物的敏感性 30株雞源大腸桿菌對臨床常用的抗菌藥存在嚴(yán)重的耐藥性。耐藥率如表2所示。30株臨床分離菌株均為耐3種以上不同類抗生素的多重耐藥菌株，多重耐藥率為100%，耐藥菌株多集中在對7～12種抗生素耐藥（圖2）。

表2 抗生素對臨床分離菌株的敏感性

圖1 雞源大腸桿菌耐受抗生素種類的分布

2.2 Ⅰ類整合酶基因在雞源大腸桿菌中的分布情況 PCR擴增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符，為280 bp，經(jīng)測序其與GenBank中（GQ900749）公布的Ⅰ型整合酶基因序列同源性為100%。其中有20株菌攜帶Int1Ⅰ，檢出率為66.7%，表明Ⅰ型整合子在雞源大腸桿菌中普遍存在。

2.3 整合酶陽性菌株與耐藥菌株的相關(guān)性分析

圖2 Ⅰ類整合酶基因PCR電泳圖

對藥敏試驗的結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)四環(huán)素、林可霉素、頭孢噻肟/克拉維酸和頭孢曲松在整合子陽性組的耐藥率明顯高于陰性組，并具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其他抗菌藥在兩組間的差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但是在整合子陽性組的耐藥率高于整合子的陰性組，見表3。

表3 整合子陽性和陰性組藥敏表型

2.4 基因盒插入?yún)^(qū)PCR的檢測結(jié)果 20株intI1陽性菌株中共有15株為基因盒陽性菌株，陽性率為75%，部分電泳結(jié)果見圖3。測序后發(fā)現(xiàn)共兩種基因盒類型，分別命名為A和B。A類基因盒大小為1 750 bp，與GenBank已公布序列進行對比。結(jié)果顯示，A類基因盒與GenBank公布的EF488368.1序列中基因盒插入?yún)^(qū)的序列符合率為98%，其排列為dfr17+aadA5，分別編碼Ⅰ型二氫葉酸還原酶和氨基糖-3′-腺苷轉(zhuǎn)移酶的耐藥基因。B類基因盒與GenBank公布的FJ266018.1序列中基因盒插入?yún)^(qū)的序列符合率為99%，大小為1 989 bp，B類基因盒的排列為dhfr+aadA2，分別編碼二氫葉酸還原酶和氨基糖-3’-腺苷轉(zhuǎn)移酶的耐藥基因。

圖3 基因盒插入基因PCR產(chǎn)物的電泳圖譜

20株整合酶陽性菌株中，檢出A類基因盒的菌株有10株，檢出率為50%；僅5株檢出B類基因盒，檢出率為20%；基因盒陽性在所有菌株中的檢出率50%。基因盒陽性菌株與多藥耐藥關(guān)系見圖4；耐抗生素種類在8個以上的均為基因盒陽性菌株。

3 討論

近年來由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，使得人醫(yī)臨床和獸醫(yī)臨床大量出現(xiàn)耐藥性細(xì)菌，很多細(xì)菌甚至對數(shù)10種抗菌藥物都耐藥，這給治療帶來極大的困難。目前，整合子系統(tǒng)所介導(dǎo)的細(xì)菌的耐藥機制對多藥耐藥性研究具有重要的意義[2]。細(xì)菌在發(fā)生水平轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生耐藥機制的主要途徑就是依靠整合子來完成的。

大腸桿菌是人獸共患的一種條件致病菌。有報道稱，敏感株的基因變異或者耐藥基因的水平傳遞等都是大腸桿菌多重耐藥的主要原因[3]，臨床檢出的耐藥大腸桿菌中多數(shù)都含有整合子結(jié)構(gòu)，且以Ⅰ類整合子為主[4]。據(jù)文獻報道，歐美國家不同來源的腸桿菌中有近43%的菌株中含有整合子存在，其中第Ⅰ類整合子占耐藥菌株的75%[5]，本研究結(jié)果顯示，30株臨床分離的菌株中，20株具有整合酶基因，檢出率為66.7%，這一結(jié)果與國內(nèi)外多數(shù)結(jié)果相似[6-7]，說明雞源大腸桿菌中第Ⅰ類整合酶基因普遍存在。整合酶陽性菌株與耐藥菌株的相關(guān)性結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)整合子陽性組的耐藥率明顯高于陰性組。可見Ⅰ類整合子的陽性檢出率與大腸桿菌的多重耐藥性密切相關(guān)。

Ⅰ型整合子的可變區(qū)大小在1 000～3 000 bp，可有種類、數(shù)量、結(jié)合方式和部位都不相同的基因盒[8]，從而決定著細(xì)菌對不同抗菌藥物的耐藥性。本試驗中Ⅰ類整合子檢測結(jié)果與藥敏試驗的數(shù)據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，基因盒陽性菌株均表現(xiàn)出對8耐以上的多重耐藥性，共得到兩種基因盒類型，均編碼二氫葉酸還原酶和氨基糖-3′-腺苷轉(zhuǎn)移酶的耐藥基因，且這兩種基因分別介導(dǎo)磺胺類藥物和氨基糖苷類藥物耐藥，同文獻報道相同[9]。有報道稱大腸桿菌整合子攜帶基因盒種類與細(xì)菌的耐藥表型并不完全一致[10]，本試驗顯示菌株均呈現(xiàn)多重耐藥性，耐藥譜包括了氨基糖苷類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等，而檢出的耐藥基因盒主要表達對磺胺類和氨基糖苷類藥物耐藥，其他耐藥基因盒并未檢出，說明Ⅰ類整合子雖然廣泛存在于雞源大腸桿菌中，但并非細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性的惟一因素。本研究結(jié)果顯示，在寧夏地區(qū)，雞源大腸桿菌對臨床常用的抗菌藥物存在嚴(yán)重的耐藥性，整合子檢出率較高，而且與細(xì)菌的耐藥性有密切關(guān)系。

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