RP-HPLC法測定術苦芩顆粒中黃芩苷和苦參堿含量

邱 洪，朱兆榮，劉 娟，凌榕鑌，羅藝晨

（西南大學榮昌校區動物醫學系，重慶 榮昌402460）

術苦芩是根據中獸醫理論和臨床辨證的原則，選用黃芩、苦參、白術、金銀花、藿香等多味中藥組成的復方制劑[1]。臨床試驗證明，其能有效改善犬細小病毒病所致的免疫力下降，對犬細小病毒病具有一定預防和治療作用[2-3]，同時能對細小病毒病犬的各種組織器官起到較好的保護作用[4-7]。鑒于方中清熱解毒的黃芩，燥濕、利水的苦參，補脾健胃的白術，均為術苦芩的君藥；金銀花、白頭翁、黃芪及藿香等具有清熱解毒、止痢，補氣升陽、利水消腫，芳香化濕、行氣和中等功效，共為臣、佐藥。此方諸藥合用，可清熱燥濕，利水止痢，治濕熱泄瀉之癥等[8]。術苦芩顆粒劑主要含有黃芩苷、苦參堿，而其活性成分具有抗感染、免疫調節、抗心律失常、降壓、抗腫瘤、抗過敏、抗病毒及解熱鎮痛等作用[9-11]，因此選定黃芩苷和苦參堿作為日后工業化生產術苦芩顆粒提供有效質量控制標準之一。本試驗建立了術苦芩顆粒劑HPLC色譜法測定其中主要有效成分黃芩苷和苦參堿的含量方法，為其質量控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試藥與試劑 術苦芩顆粒（1 g生藥/g，西南大學榮昌校區動物醫學系獸醫科學研究中心中藥創新實驗室研究，重慶市天龍牧業科技有限公司生產，批號：20110820，20110829，20110910）；黃芩苷標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110423）；苦參堿標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110805-200508）；乙腈（Honeywell Burdick＆Jackson Ulsan，批號：N6QA1H，色譜級）；甲醇（SKChemicals，批號：AH230-4，色譜級）；磷酸（川東化工有限公司，批號：20121001，分析級）；三乙胺（上海實驗試劑有限公司，批號：20131211，分析級）。

1.2 主要儀器設備 SPD-20A紫外檢測器（日本島津公司）；DGU-20A3脫氣機（日本島津公司）；LC-20AD型泵（日本島津公司）；CTO-20A柱溫箱（日本島津公司）；AB135-S電子分析天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）；純水儀；SB-25-12型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；C18柱4.6mm×250mm，5μm（島津公司）；4.6mm×150mm，5μm，WelchWaterials公司。

1.3 試藥準備與檢測方法

1.3.1 對照品溶液制備 分別取黃芩苷對照品和苦參堿對照品適量，精密稱定，加各自的流動相制成每毫升含黃芩苷60μg的溶液和每毫升含苦參堿50μg的溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液制備 取術苦芩顆粒適量，研細，過七號篩。黃芩苷供試品：取0.5 g細粉于具塞錐形瓶中，精密加入100mL甲醇，密塞，稱重，超聲（250 W，35 kHz）30min，稱重，用甲醇補足減失重量，濾過，精密量取濾液10mL至100mL容量瓶中，即得?？鄥A供試品：取3 g細粉于具塞錐形瓶中，精密加入28.8mL氯仿和1.2mL氨水，密塞，稱重，在超聲（250W，35kHz）20min，稱重，用三氯甲烷補足減失重量，濾過，精密量取濾液10mL至蒸發皿，水浴蒸干，殘渣用流動相溶解后轉移至10mL容量瓶中，用流動相定容即得。

1.3.3 色譜條件 均以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：30℃；進樣10μL；流速：1mL/min。黃芩苷色譜條件以甲醇-0.4%磷酸溶液（用三乙胺調節pH值至3.0）（52∶48）為流動相，檢測波長為274 nm。

苦參堿色譜條件以乙腈-甲醇-0.2%磷酸溶液（用三乙胺調節pH值至7.0）（22∶13∶65）為流動相，檢測波長為220 nm。

1.3.4 線性關系 取黃芩苷對照品儲備液 200μg/mL，用流動相依次稀釋為150μg/mL、100μg/mL、50 μg/mL、25μg/mL、10μg/mL。取苦參堿對照品儲備液400μg/mL，用流動相依次稀釋為200μg/mL、150 μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL。按1.3.3色譜條件方法分別進行測定，進樣10μL，測定結果以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，用最小二乘法進行線性回歸分析。

1.3.5 專屬性 分別取等份的不含黃芩的術苦芩顆粒、不含苦參的術苦芩顆粒和術苦芩顆粒適量，按1.3.2方法配置陰性對照供試品溶液和供試品溶液。用1.3.3色譜條件進行測定，考察此方法的專屬性。

1.3.6 精密性和重復性 用1.3.2方法制備供試品溶液，用1.3.3色譜條件測定，平行測定6次，計算結果的相對標準偏差RSD，來考察儀器精密性。精密稱取同一批術苦芩顆粒6份，按1.3.2方法制備供試品溶液，分別進樣，記錄黃芩苷峰面積和苦參堿峰面積，計算結果的相對標準偏差RSD，來考察樣品測定的重復性。

1.3.7 加樣回收率 精密量取術苦芩顆粒1.25 g于錐形瓶中，電子天平精密加入黃芩苷對照品10.0mg。精密量取術苦芩顆粒3.0 g于錐形瓶中，電子天平精密加入苦參堿對照品1.8 mg。按照

1.3.2 方法和1.3.3色譜條件分別進行處理和測定，計算加樣回收率，重復6次。

1.3.8 定量限 分別準確稱取5份不含苦參的術苦芩顆粒，按1.3.2樣品處理方法進行處理，測得基線噪音平均值。用流動相稀釋供試品溶液成不同濃度的供試液，依1.3.3色譜條件進行測定，以響應信號和噪音之比（S/N）為10的最低稀釋濃度作為定量限。

1.3.9 耐用性 在原方法基礎上，分別改變如下條件。黃芩苷耐用性考察：樣品處理時間（20min、30 min、40min）、流動相配比（50∶50、52∶48、54∶46）、pH值（2.8、3.0、3.5）、溫度（25℃、30℃、35℃），以及色譜柱規格（4.6μm×150mm、4.6μm×250mm）?？鄥A耐用性考察：樣品處理時間（10min、20min、30 min）、流動相配比（25∶15∶60、22∶13∶65、18∶12∶70）、pH值（6.5、7.0、7.5）、溫度（25℃、30℃、35℃），以及色譜柱規格（4.6μm×150mm、4.6μm×250mm），再對測定結果的色譜圖的分離度，拖尾因子進行評測，考察該色譜方法的耐用性。

2 結果

2.1 線性關系 用建立的含量測定方法分別測定系列黃芩苷對照品溶液和苦參堿對照品溶液，其濃度與峰面積的線性回歸方程分別為Y=5.56763×10-8X-2.79465×10-3（r=0.99991）和Y=3.4334×104X-2.0406×103（r=0.99994），說明在黃芩苷和苦參堿分別在濃度為10μg/mL～150μg/mL和10μg/mL～400μg/mL范圍內與峰面積均呈良好線性關系。

2.2 專屬性 測定結果色譜圖見圖1，在黃芩苷對照品和苦參堿對照品峰的保留時間上供試品顯示，按供試品配置方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12 h，進行測定得出術苦芩中黃芩苷和苦參堿峰面積的相對標準偏差分別為0.096%和0.280%。精密試驗結果顯示，對同一供試品溶液平行測定6次，測得黃芩苷和苦參堿的峰面積的相對標準偏差分別為0.023%和0.653%，精密性符合2010年版獸藥典含量測定方法RSD＜2.0%的規定，此法的精度性符合含量測定的要求。重復性試驗結果顯示，計算黃芩苷均有相應的色譜峰出現，陰性對照無對應色譜峰，表明用此法在測定術苦芩顆粒中黃芩苷含量和苦參堿含量時均具有較好的專屬性。

2.3 穩定性、精密性和重復性 穩定性試驗結果和苦參堿峰面積的RSD分別為0.228%和0.997%，表明重復性良好。

2.4 加樣回收率 分別精密稱取6份術苦芩顆粒3.0 g于錐形瓶，精密加入黃芩苷對照品10.0mg和苦參堿對照品1.8mg，其他按照1.2.3方法制備，分別測定。測得結果為術苦芩中黃芩苷和苦參堿的平均回收率分別為99.22%（RSD為0.641%）和98.33%（RSD為1.257%），結果見表1。

2.5 定量限 根據5個陰性對照的基線噪音平均值分別為噪音值N1（黃芩苷）和N2（苦參堿），術苦芩顆粒供試品檢測黃芩苷峰信號和苦參堿峰信號為信號值（S1和S2），以S/N≥10作為定量標準，測得此法測定術苦芩顆粒中黃芩苷含量和苦參堿含量的定量限分別為2μg/mL和4μg/mL。

表1 加樣回收率試驗結果

2.6 樣品測定 取不同批的術苦芩顆粒樣品6份，精密稱定，按1.3.2方法制備供試品溶液，進樣10μL，記錄色譜峰，計算苦參堿的含量，結果見表2。

表2 術苦芩顆粒中黃芩苷和苦參堿的含量 （n=6）

2.7 耐用性 試驗通過改變樣品處理時間、色譜條件中流動相的配比、流動相的pH值、柱溫、色譜柱類型以考察此法的耐用性。試驗結果顯示，在條件改變的情況下，樣品中黃芩苷波峰和苦參堿波峰的分離度均＞2、拖尾因子均介于0.95～1.05之間、理論塔板數均在10 000以上。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察 采用超聲法處理供試樣品，其超聲震蕩作用均加大了黃芩苷和苦參堿的溶出度及溶出速度[13]；同時，利用三氯甲烷增加苦參堿溶出率[14-17]。在超聲提取方法中，考察了超聲不同時間（黃芩苷：20min、30min、40min，苦參堿：10min、20min、30min）的提取效果，結果表明，在分別超聲30min后和20min后提取的黃芩苷和苦參堿經測定均無顯著變化，因此提取黃芩苷和苦參堿分別選取超聲30min和20min。

3.2 檢測波長的選擇 取黃芩苷對照溶液和苦參對照品溶液作紫外光譜掃描，結果可見黃芩苷在274 nm和苦參堿在220.1 nm波長處有最大吸收，且在分別在（273.2±3）nm和（219.2±2）nm波長范圍內吸收穩定，基線較好，對測定無干擾。因此，參考2010年版《中國藥典》（一部）中關于黃芩藥材中黃芩苷和苦參藥材中苦參堿的檢測標準中的最大吸收波長，并結合本研究，最終選用274 nm和238 nm作為本試驗的檢測波長。

3.3流動相的選擇 C18為填充物的反向色譜柱作為分析柱，黃芩苷的流動相有機相組分為甲醇，無機相選擇0.4%磷酸溶液（用三乙胺調節pH值至3.0）?？鄥A的流動相有機相組分為乙腈和甲醇，無機相選擇0.2%磷酸溶液（用三乙胺調節pH值至7.0）。黃芩苷的峰形和苦參堿的峰形均較好，且與相鄰雜質峰都能達到較好的分離，保留時間適中。

3.4 本試驗建立了術苦芩顆粒中黃芩苷和苦參堿含量高效液相色譜檢測方法 分別以甲醇和三氯甲烷作為溶劑用超聲法對顆粒劑進行處理，C18色譜柱作為分析柱，紫外檢測器檢測。所建立的方法的專屬性、穩定性、準確性、檢測靈敏度及方法的耐用性能滿足術苦芩顆粒中黃芩苷含量和苦參堿含量測定的要求。

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