UPLC-MS/MS檢測七種動物源食品中四環素類藥物殘留量的研究

張鑫，吳劍平，李丹妮，嚴鳳，曹瑩，顧欣

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

?

UPLC-MS/MS檢測七種動物源食品中四環素類藥物殘留量的研究

張鑫，吳劍平，李丹妮，嚴鳳，曹瑩，顧欣*

(上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103)

研究并優化了七種不同動物源食品中四環素、土霉素、金霉素、多西環素殘留的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。選用Na2EDTA-McIlvaine緩沖溶液作為提取液，超聲提取七種動物源食品中四環素類殘留，C18固相萃取小柱凈化，脫溶劑后用甲醇水溶解，在超高效液相色譜-串聯質譜上進行檢測。結果顯示，豬肉、雞肉、雞蛋、魚肉、牛奶中四環素類藥物殘留的最低定量限(LOQ)為10 μg/kg，豬腎、豬肝最低定量限(LOQ)為20 μg/kg，在定量限到2倍最大殘留限量(MRL)的添加范圍內，回收率為75%±25%,RSD<10%，可以滿足農業部235號公告的要求。

獸藥殘留；四環素類；優化；超高效液相色譜-串聯質譜

隨著人民生活水平的提高，消費者對畜產品的需求更加多樣化，對食品質量安全的要求也更高，四環素類等抗生素在動物性食品中的殘留問題受到關注。四環素類藥物是一類廣譜抗生素，在畜禽、水生生物等產業領域應用此類藥物可對動物進行診斷、預防和治療疾病，同時促進動物生長、提高飼料轉化率，帶來可觀的經濟效益。養殖中濫用四環素類藥物會導致動物體內該類藥物的殘留，人們長期食用這種動物食品及其制品，會危及身體健康。農業部在235號公告中規定了四環素類藥物在動物性食品中最高殘留限量(MRL)，以監管養殖業規范用藥。目前已發布的檢測標準(農業部958號公告-2-2007及GB/T 5009.116-2003)及文獻方法多為液相色譜法[1-2]，檢測限及靈敏度受到檢測器的局限。已發布的液相色譜-質譜聯用法檢測標準有兩個，GB/T 21317-2007中方法檢測限定為50 μg/kg，且未涉及雞蛋中四環素類殘留量的檢測方法，農業部1025號公告-12-2008僅適用于豬肉、雞肉組織中四環素、土霉素及金霉素殘留量的檢測。已發表的相關文獻[3-5]針對不同基質給出的檢測方法各異，給實際監測工作帶來了不便。本文在已有工作的基礎上，針對我國消費量較大的豬肉、雞肉、雞蛋、魚肉、牛奶、豬肝、豬腎等7種組織，制定出相對統一的檢測方法，通過考察前處理操作和儀器條件對結果的影響，優化檢測方法，為實現動物源性食品中四環素藥物殘留的確證檢測、有效監控四環素類藥物的使用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters TQ Xevo串聯四極桿質譜(ESI+)、固相萃取小柱(Waters HLB 3mL/60mg)、C18色譜柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；高速冷凍離心機(Allegra X-22R，美國Beckman Coulter)；水浴控溫氮吹儀(N-EVAP，上海安譜公司)。標準品：土霉素(純度98.5%)、四環素(純度96.5%)、金霉素(純度92%)、多西環素(純度98.7%)，均為SIGMA公司生產。乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，德國Merk)；去離子水(自制，電阻率≥18 MΩ·cm)；草酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸，為化學純；高純氮、高純氬(純度均為99.999%，上海佳杰特種氣體公司)。

標準溶液的配置：精密稱取土霉素、四環素、金霉素、多西環素標準品各10 mg，用甲醇溶解制成1 mg/mL的標準貯備液。取土霉素、四環素、金霉素、多西環素貯備液適量，用甲醇配制成混合標準工作液，并用甲醇/水溶液(50:50，V/V)稀釋成濃度為1、10、20、50、100 ng/mL的標準曲線。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜方法 色譜柱：C18柱(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸，采用梯度洗脫：20%A起始，4 min時變化至50%A，保持0.5 min，5 min時變化至20%A。

1.2.2 質譜方法 離子源：ESI+；檢測方式：多反應監測MRM；電離電壓3.2 kV；源溫150 ℃；霧化溫度500 ℃；錐孔氣流速50 L/h；霧化氣流速800 L/h。定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞電壓見表1。

表1 四環素類藥物的定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞電壓的參考值

1.2.3 前處理方法 提取方法：①豬肉、雞肉、雞蛋、魚肉：稱取5.00 g試樣于50 mL離心管中，準確加入15 mL提取液(McIlvaine- Na2EDTA緩沖液[2])，充分振蕩5 min，然后于0 ℃離心5 min(離心力8000 g)，轉移至另一潔凈離心管中，準確加入15 mL提取液重復提取一次，合并上清液備用。②豬肝、豬腎：稱取5.00 g試樣于50 mL離心管中，準確加入25 mL提取液，5%三氯乙酸5 mL，充分振蕩10 min，于0 ℃離心5 min，上清液備用。③牛奶：稱取5.00 g牛奶于50 mL離心管中，準確加入提取液定容至30 mL，充分振蕩5 min，0 ℃離心5 min，上清液備用。

凈化方法：HLB固相萃取小柱依次用甲醇、水、提取液各3 mL活化。取備用液6 mL過柱，用3 mL 5%甲醇水淋洗，抽干，用0.01 mol/L草酸甲醇溶液4 mL洗脫，收集洗脫液，60 ℃下旋轉蒸發至干，用1 mL甲醇/水溶液(50:50,V/V)溶解，過0.22 μm濾膜后上機測定。若待測樣品濃度超出線性范圍，用甲醇/水溶液(50:50,V/V)稀釋至線性范圍后上機測定。

2 結果與分析

2.1 線性關系 土霉素、四環素、金霉素、多西環素標準曲線見圖1，數據表明在1～100 ng/mL范圍內，四種藥物的線性相關系數R>0.999，線性良好。

圖1 四環素類標準曲線(曲線濃度范圍為1～100 ng/mL)(A：土霉素；B：四環素；C：金霉素；D：多西環素)

2.2 方法回收率 在確定樣品預處理方法后，選擇豬的肌肉、肝臟、腎臟，雞肉、雞蛋，牛奶，魚肉作為測試對象，進行加標回收率實驗，添加四環素類濃度為方法定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四個濃度的試樣的樣品，考察方法的準確性和精密度。同一濃度做6次平行實驗，平均回收率R及標準偏差RSD見表2，結果表明，土霉素、金霉素、多西環素回收率達到70%～100%，四環素回收率達到50%～80%，RSD<10%，表明該方法對不同基質樣品中不同含量的四環素類藥物的測定均有較好的準確度(圖2)。

表2 四環素類檢測準確性和精密度數據結果表

圖2 基質添加回收MRM譜圖(A四環素類藥物標準品20 ng/mL；B空白豬肉中添加20 ng/g； C空白牛奶中添加20 ng/g； D空白豬腎中添加20 ng/g)

2.3 靈敏度、檢測限和定量限 UPLC-MS/MS對四環素類藥物的檢測靈敏度低至1 ng/mL(圖3)，信噪比S/N(Peak to Peak)均遠大于10，根據前處理方法的稀釋倍數為1，推測方法定量限可定為1 μg/kg，檢出限可以更低，但由于存在基質干擾，1 μg/kg添加回收率超出100%，定量不準，因此本方法不能簡單用S/N>3來確定檢測限，S/N>10來確定定量限，考慮到添加回收實驗的結果，豬肉、雞肉、雞蛋、魚肉、牛奶中四環素類藥物殘留的最低定量限(LOQ)為10 μg/kg，豬腎、豬肝最低定量限(LOQ)為20 μg/kg，信噪比見圖4所示。

3 討論與小結

3.1 流動相的選擇 通過比較四種流動相甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.01 mol/L三氟乙酸梯度洗脫，發現流動相中未加入0.1%甲酸的情況下，四環素類藥物的電離效果較差，峰型對稱性差，在加入一定比例的0.1%甲酸后，得到了改善，0.01 mol/L三氟乙酸也有類似的效果，考慮到0.1%甲酸更適合質譜，最終選擇乙腈∶0.1%甲酸作為流動相。

圖3 四環素類標準品MRM圖(濃度為1 ng/mL)

圖4 添加回收樣品MRM圖信噪比(A豬肉中四環素類藥物添加濃度10 μg/kg；B豬肝中四環素類藥物添加濃度20 μg/kg)

3.2 工作液稀釋溶劑的選擇 嘗試選擇溶劑分別為0.2%甲酸、0.2%甲酸/甲醇(80/20,V/V)、0.01 mol/L三氟乙酸/乙腈(50/50,V/V)、甲醇/水(20/80,V/V)、甲醇/水(50/50,V/V)等作為最終進樣前的樣品溶劑進行實驗，發現溶劑pH值對樣品的影響較大，而甲醇與水的比例對樣品的影響較小，但高有機相比例的溶劑對樣品殘渣的溶解性較好，為保持一致，標準品的稀釋溶劑選擇甲醇/水(50/50,V/V)。

3.3 提取溶劑的選擇 使用McIlvaine-Na2EDTA緩沖液、5%高氯酸溶液、乙腈三種提取溶劑，對四環素類藥物添加量為20 μg/kg的豬肉樣品進行提取，比較回收率發現，5%高氯酸溶液、乙腈對四種藥物的提取效率均在53%～70%之間，當提取溶劑為McIlvaine-Na2EDTA緩沖液時多西環素和金霉素的提取效率有明顯提高，分別達到74.8%和100.2%，而土霉素和四環素變化較小，分別為69.0%和65.3%，這主要是McIlvaine-Na2EDTA緩沖液競爭結合金屬離子，一定程度上減少了四環素類藥物與金屬離子的螯合反應，保證藥物的游離性，有利于藥物在SPE柱上保留。

3.4 定量方法的選擇 根據前處理實驗情況發現，經過凈化后，絕對回收在50%～60%，嘗試選擇去甲基金霉素作為內標，發現內標與四環素類藥物的回收率不一致，因此仍選擇外標法定量，通過改進前處理方法以提高回收率。

3.5 去除蛋白方法的選擇 使用三氯乙酸(5%)、硅鎢酸(5%)、高氯酸(1%，2%，5%，10%)、正己烷去脂、濾紙過濾等凈化方法對豬肝樣品(添加量為20 μg/kg)的提取液進行凈化，比較回收率發現，對于不同基質，結果有所不同。對于豬肉、雞肉、魚肉、牛奶、雞蛋等，加去蛋白或去脂的試劑意義不大，但對于豬肝、豬腎等，此步驟可以提高回收。使用三氯乙酸(5%)、高氯酸(1%或2%)可得到相對較高的回收率，其中土霉素、四環素、多西環素和金霉素的回收率最高可達79.0%、68.2%、79.0%和98.5%。對于豬肝、豬腎樣品，實驗室可根據實際情況選擇三氯乙酸(5%)、高氯酸(1%或2%)作為凈化試劑。

3.6 固相萃取柱的選擇 比較了Waters HLB、BondElut C18、Agilent OPT固相萃取小柱的凈化效率，后兩者比HLB小柱略低，三種型號沒有明顯差異，C18填料的固相萃取小柱均可以滿足要求。同時，比較規格為3mL/60mg和6mL/150mg的HLB固相萃取小柱，發現相同的上樣量，6 mL小柱需要兩倍體積以上的溶劑洗脫才能與3 mL的小柱回收率相當，增加工作量及成本，而回收率沒有顯著差別，因此選擇規格為3mL/60mg的小柱。

3.7 固相萃取方法的選擇 C18填料的固相萃取小柱，通常使用甲醇、水活化，但是，四環素類藥物在弱酸性環境中更穩定，因此使用提取液(McIlvaine- Na2EDTA緩沖液)提供弱酸性柱上環境，發現回收率提高10%。同時，提取液上樣量應與SPE填料量相匹配，考察了對3mL/60mgWaters HLB固相萃取小柱上樣量分別為3、6、10 mL對回收率的影響，發現3 mL和10 mL均低于上樣量為6 mL時的回收率。

實驗結果顯示，本方法具有靈敏度高、準確性好的優點，通過優化前處理和儀器條件，提高了回收率。本文考察了該方法對多種基質的適用性，并提出改進方案，給出不同基質的定量限，是對現有標準的改進和補充，可為動物源食品中的四環素類殘留的檢測提供可靠的確證方法。

[1] 龐國芳,曹彥忠,張進杰,等.高效液相色譜法同時測定禽肉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留的研究[J].分析測試學報,2005,4:61-63.[2] 張鑫,顧欣,嚴鳳,等.高效液相色譜法檢測畜禽肉中四環素類藥物殘留的條件優化[J].化學分析計量,2010,5:55-58.

[3] 孫雷,張驪,劉琪,等.豬肉組織中四環素類藥物殘留檢測——高效液相色譜-串聯質譜法研究[J].中國獸藥雜志,2008,2:27-29.

[4] 劉艷華,張純萍,門立強,等.液相色譜-串聯質譜法測定雞肌肉組織中的四環素類藥物殘留[J].色譜,2006,2:171-173.

[5] 李月歡,劉志權,陳硯朦,等．UPLC-ESI-MS/MS檢測畜、禽肉中土霉素、四環素、金霉素殘留量[J].中國衛生檢驗雜志,2008,1:96-98.

[6] 洪武興,孫良娟,劉益鋒,等.液質聯用法檢測水產品中四環素類殘留[J].現代食品科技,2010,7:756-758.

[7] 賈薇,孫璐,史向國,等.液相色譜-質譜聯用法測定牛奶中4種四環素類藥物殘留量[J].沈陽藥科大學學報,2002,2:96-100.

[8] 岳振峰,邱月明,林秀云,等.高效液相色譜串聯質譜法測定牛奶中四環素類抗生素及其代謝產物[J].分析化學,2006,9:1255-1259.

(編輯：侯向輝)

Optimized Determination of Tetracyclines in Seven Kinds of Animal Derived Food by UPLC/MS/MS

ZHANG Xin,WU Jian-ping,LI Dan-ni,YAN Feng,CAO Ying,GU Xin*

(ShanghaiAnimalDiseaseControlCenter，Shanghai201103，China)

A UPLC/MS/MS method for determination of the residues of tetracyclines(tetracycline，oxytetracycline，chlortetracycline and doxycycline)in seven different kinds of animal derived food was studied and optimized.The tetracyclines in seven kinds of animal derived food were pretreated with extraction by Na2EDTA-McIlvaine buffer solution，purification by C18 SPE column,dissolution by CH3OH/H2O(50/50,V/V) after desolvation，and then determined by UPLC/MS/MS.The results showed that the recoveries were in the range of 50%～100% when blank samples spiked with tetracyclines in 10 μg/kg or 20 μg/kg～2MRL,and the relative standard deviation was less than 10%.The method could satisfy the request of legislation on maximum residue limits in the ministry of agriculture 235 announcement.

veterinary residue；tetracyclines；optimize；UPLC/MS/MS

上海市市級農口系統青年人才成長計劃(滬農青字(2014)第2-5號)；上海市科技興農重點攻關項目(滬農科攻字(2013)第6-9號)

張鑫，碩士，畜牧師，從事獸藥殘留分析研究。

顧欣。E-mail：guxun@sh163.net

2015-10-27

A

1002-1280 (2015) 12-0036-07

S859.84