反硝化細菌對生物濾池濾料掛膜及水處理效果的初步研究

張 濤，周朝生*，羅海忠，吳洪喜，馬建忠，胡利華，胡 園

(1.浙江省海洋水產養殖研究所，浙江溫州 325000;2.舟山市水產研究所，浙江舟山 316000)

近年來，隨著勞動力成本增加、水產養殖過程中病害的頻發和水產品質量安全的需要，人們開始由傳統養殖模式逐步轉向工廠化養殖模式［1-2］。工廠化養殖模式的關鍵技術是水處理技術［3］:第一要去除養殖污水中的固體物;第二是控制養殖水體中的溶解氧;第三是殺菌消毒;第四是降解溶解性有機物［4］。然而降解溶解性有機物，主要依靠微生物技術［5-6］。反硝化細菌就是一類能將硝態氮(NO3-N)還原為氣態氮 (N2)的微生物，在分類學上，它們散布于10個不同的細菌科中，已知50個屬以上的微生物能夠進行反硝化反應［7］，其中大部分為厭氧細菌。由于養殖水體一般需要充足的溶氧環境才能保證養殖水體中動植物正常的新陳代謝，因此在養殖水體中，就需要找到適宜的好氧反硝化細菌加以開發利用。隨著科學技術的不斷提高，研究學者發現在自然界中存在著大量的好氧反硝化細菌。最早對好氧反硝化細菌的研究始于20世紀80 年代［8］，Robertson 等［9］在除硫和反硝化處理系統出水口處首次分離出好氧反硝化菌泛氧副球菌 (Paracoccus pantotropha)、假單胞菌屬的1種(Pseudomonas spp)和糞類堿菌(Alcaligenes facalis)等。近年來國內外的專家學者不斷發現好氧反硝化細菌［10］:Su 等［11］分離到的菌株 NS-2，可在92%氧體積分數條件下進行反硝化;謝曙光等［12］對地表水處理中好氧反硝化細菌進行探討性研究，在水力負荷較高的情況下獲得總氮去除率達20% ～30%的效果;丁愛鐘等［13］則從土壤中分離出一種兼性細菌DH11，發現其能在好氧條件下還原硝酸鹽;馬放等［14］從活性污泥中分離到好氧反硝化菌株X31，好氧培養40 h后對總氮脫除率超過50%。這些研究成果為水產養殖過程中降解溶解性有機物提供了可能。

本試驗采用陶瓷環和生化環2種掛膜濾料，在試驗過程中添加的反硝化細菌為商品反硝化細菌和筆者分離培養的反硝化細菌。本試驗旨在找出一種更適應工廠化循環水養殖系統的反硝化細菌，從而為水產養殖生產實踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

商品反硝化細菌 (凈硝1號)和實驗室分離培養的反硝化細菌，200 L的玻璃缸18個，陶瓷環64 L，生化環64 L，水泵 (1 000 L·h-1)18個，15 mm PVC管18根。選擇掛膜材料有生化環和陶瓷環。生化環規格為內徑×外徑×高為7.0 mm×7.5 mm×7.0 mm，材質為聚乙烯，比表面積310 m2·m-3，黃色。陶瓷環的規格為內徑×外徑×高為9 m×17 mm×17 mm，材質陶瓷，比表面積300 m2·m-3，白色。

1.2 方法

1.2.1 配制養殖污水

污水培養試劑有氯化氨、亞硝酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀。向200 L的玻璃缸中添加100 L的新鮮海水，再添加氯化氨、亞硝酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀，使新添加的新鮮海水中亞硝酸、氨氮和COD的濃度分別為5.0，2.5，10.0 mg·L-1，然后分別放進64 L的生物掛膜材料。

1.2.2 培養基配制

選擇培養基。葡萄糖24 g，檸檬酸鈉14.7 g，硝酸鉀6.7 g。

分離培養基。葡萄糖10 g，檸檬酸鈉5 g，醋酸鈉1.5 g，氯化氨1.0 g，磷酸氫二鈉0.6 g，磷酸二氫鉀0.4 g，硫酸鎂0.1 g，酵母膏0.5 g，瓊脂粉20 g，陳海水 1 000 mL，pH值 7.6～8.2，121℃高壓滅菌20 min。

活化培養基。葡萄糖10 g，檸檬酸鈉5 g，醋酸鈉1.5 g，氯化氨1.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鈉0.6 g，磷酸二氫鉀0.4 g，硫酸鎂0.1 g，氯化亞鐵0.1 g，酵母膏0.5 g，陳海水1 000 mL，pH值7.6～8.2，121℃高壓滅菌20 min。

亞硝酸鹽還原培養基。牛肉膏10 g，蛋白胨5 g，KNO31 g，pH值7.0～7.6，121℃高壓滅菌20 mim。

篩選培養基。A培養基:葡萄糖36 g，酵母膏0.5 g，亞硝酸鈉2.1 g，陳海水1 000 mL，pH值7.6～8.2，121℃高壓滅菌20 min。B培養基:葡萄糖36 g，酵母膏0.5 g，硝酸鹽鈉2.6 g，陳海水1 000 mL，pH值 7.6～8.2，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 細菌培養

從舟山市水產研究所朱家尖基地大黃魚養殖車間污水處理池中獲得養殖污水，對其進行營養強化。加入反硝化細菌的選擇培養基，培養反硝化細菌，然后對反硝化細菌進行分離培養，提純反硝化細菌。再加入活化培養基，對反硝化細菌進行活化培養。為驗證反硝化細菌的還原性，同時加入亞硝酸鹽還原培養基。最后，提取反硝化細菌DNA，鑒定實驗室分離培養的反硝化細菌。

開啟循環泵運行循環養殖用水，當循環水運轉到第4天時，向玻璃缸中分別添加商品反硝化細菌和實驗室分離培養的反硝化細菌。添加前采用無菌雙蒸水對二者進行稀釋，在紫外線分光光度計下測量二者的吸光值都在2.0的情況下時，分別吸取45 mL的商品反硝化細菌和實驗室分離培養的反硝化細菌予以添加，以控制其相同試驗濃度。當循環水運行至第10天時，再向每個玻璃缸中追加相同體積和密度的10 mL不同來源的反硝化細菌。各試驗組設置不添加反硝化細菌的空白對照組。培養條件:28～32℃，溶解氧 6～8 mg·L-1，鹽度2.80% ～3.23%，pH值7.8～8.5。

1.3 測定項目及數據統計

2 結果與分析

2.1 不同來源反硝化細菌對的降解情況

圖1 濃度的變化

2.2 不同來源反硝化細菌對的降解情況

通過圖2可知，在各試驗組運行前期，亞硝酸鹽含量都有輕微上升的趨勢，其中分離培養反硝化細菌生化環試驗組濃度最高，達到5.8 mg·L-1，這比試驗初始濃度高出0.8 mg·L-1。試驗運行到第9天以后，陶瓷環組亞硝酸鹽含量開始下降，試驗運行12 d后，生化環組亞硝酸鹽含量開始下降;15 d后，陶瓷環和生化環空白對照組亞硝酸鹽含量開始下降;21 d前后，各試驗組降解亞硝酸鹽速率都開始下降，其降解趨勢也變得比較平緩。添加反硝化細菌陶瓷環組試驗組中，分離培養的反硝化細菌組在試驗前期的亞硝酸鹽濃度比商品反硝化細菌組高，進入降解期時，分離培養的反硝化細菌組亞硝酸鹽濃度低于商品反硝化細菌組，且降解性能穩定。添加反硝化細菌生化環組剛開始分離培養反硝化細菌試驗組中亞硝酸鹽含量濃度要比商品反硝化細菌試驗組高，試驗進入快速降解初期，分離培養反硝化細菌組的濃度要比商品反硝化細菌高，直到試驗運行18 d后，分離培養的反硝化細菌試驗組中亞硝酸鹽含量才比商品反硝化細菌組低。試驗運行至30 d時，檢測到添加分離培養反硝化細菌陶瓷環組和商品反硝化細菌陶瓷環組的亞硝酸鹽濃度分別為0.07和0.11 mg·L-1，添加分離培養的反硝化細菌生化環組和商品反硝化細菌生化環組的亞硝酸鹽濃度分別為0.09和0.13 mg·L-1。對照組中，15 d前，陶瓷環亞硝酸鹽含量較生化環高，15 d后比生化環低。綜上，分離培養反硝化細菌陶瓷環組降解亞硝酸鹽效果最好，同時，試驗組和對照組降解亞硝酸鹽差異明顯，添加反硝化細菌試驗組降解NO-2較未添加的對照組效果要好。

圖2 濃度的變化

2.3 不同來源反硝化細菌對COD的降解情況

由圖3可知，不同材料添加不同來源反硝化細菌，各試驗組降解COD的變化趨勢基本一致，即COD的降解速率較平緩。試驗運行30 d，不同來源反硝化細菌降解COD差異性不明顯，且降解COD的效果不理想，對COD的去除率僅為30.9%～37.9%。其中，分離培養的反硝化細菌陶瓷環試驗組降解COD的去除率最高，為37.9%;而添加分離培養的反硝化細菌生化環組降解COD去除率為35.5%，二者均為所在各自試驗組中去除COD的效率最高。由此說明，分離培養的反硝化細菌降解COD效果最好。

圖3 COD濃度的變化

3 小結與討論

2種不同來源的反硝化細菌對NH+4降解效果較明顯，均在98.9%以上。其中陶瓷環組，實驗室分離培養反硝化細菌和商品反硝化細菌對NH+4的降解效率分別為99.4%和97.6%;生化環組，實驗室分離培養的反硝化細菌和商品反硝化細菌對的降解效率分別為96.4%和95.6%。通過陶瓷環和生化環添加不同來源反硝化細菌進行比對可得出結論，即分離培養的反硝化細菌較商品反硝化降解效率要高。而添加反硝化細菌試驗組和空白對照組比較顯示，對照組比添加反硝化細菌試驗組對的降解效率較低，且降解效果也較理想，均在96.5%以上。

添加不同來源反硝化細菌的陶瓷環和生化環降解COD的效果不很理想，且各試驗組降解COD的差異不明顯，去除率在35.5% ～37.9%，還需進一步研究和討論。

本次試驗所用的養殖污水均采用化學試劑配制模擬，雖試驗達到預期目標，也探討了各種掛膜濾料降解養殖污水性能的差異，但考慮到試驗要貼近生產實踐，故接下來應采用養殖生產池中產生的養殖污水來進行試驗并加強觀察和記錄。下一步擬考慮在試驗組的玻璃缸中養殖一定密度的水產動物，結合觀察水產動物的生長習性，總結添加反硝化細菌對其生長的影響，為養殖生產提供理論參考。

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