人羊膜間充質干細胞移植治療帕金森病模型大鼠的療效評價

陳 勇，方 寧，陳代雄，趙春華

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種以黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經元進行性死亡為特征的神經退行性疾病，主要臨床表現為靜止性震顫、肌僵直和運動障礙。目前PD 尚無根治方法，傳統治療以藥物為主，療效減退后可行手術治療，但都只能控制癥狀，而且有發生不良反應和并發癥風險。隨著干細胞技術的發展，采用胚胎干細胞、神經干細胞、間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療PD 患者或動物模型已取得很大進展，可望成為治療PD 的新手段［1～3］。近年來，人羊膜間充質干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)的生物學特性及其在再生醫學領域的應用價值越來越受到關注。hAMSCs 來源于胚外中胚層，除具有多向分化潛能外，還具有低免疫原性和免疫調節作用［4，5］。此外，hAMSCs 來源豐富、易于制備、無倫理限制等優勢。近期幾項研究證明，hAMSCs 原位移植可促進腦、脊髓、外周神經損傷模型動物病損神經組織的修復和明顯改善運動功能［6～8］，表明hAMSCs 對神經性疾病具有潛在的治療價值。移植途徑對hAMSCs 治療效應的影響、生物效應的持續時間及其在宿主體內的命運等是臨床前研究值得關注的重要問題。本實驗通過動態觀察，進一步評價原位和靜脈hAMSCs 對PD 模型大鼠的療效及其在腦組織中的存活、分化。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雌性Wistar 大鼠40 只，體重220～250 g，購自第三軍醫大學大坪醫院動物實驗中心［許可證號:SCXK(渝)2007-0005］。LGDMEM 培養基和FBS(GIBCO，烏拉圭);GlutaMax(GIBCO 公司，美國);小鼠抗人細胞核抗體(MAB1281;Chemcion，美國);兔抗人神經元微管結合蛋白(microtubule associated protein-2，MAP-2)抗體(SANTA CRUZ，美國);阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)、Ⅱ型膠原酶、6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)和小鼠抗人波形蛋白抗體(Sigma，美國);流式細胞術檢測抗體CD29-PE、CD34-PE、CD45-FITC、CD44-FITC、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、CD80-FITC、CD86-PE 和HLA-DR-FITC(BD，美國);兔抗大鼠酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase，TH)抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 hAMSCs 的分離、培養及表型分析 經產婦知情同意采集足月剖宮產羊膜，參照文獻［9］采用胰蛋白酶-膠原酶消化法分離hAMSCs，將分離的hAMSCs 懸浮于含10%FBS、1%GlutaMAX、55 μmol/L β-巰基乙醇、1% NEAA 和5 ng/ml bFGF 的LDMEM 培養基中，按5×105/cm2接種于培養瓶，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養。細胞生長面積達80%以上即進行傳代培養，至第3 代用于細胞治療，并采用流式細胞儀(FACS Calibur.BD)檢測其表型。取第3 代hAMSCs，按組合方案加入熒光素標記的CD29-PE、CD34-PE、CD45-FITC、CD44-FITC、CD73-PE、CD90-FITC、CD105-PE、CD80-FITC、CD86-PE 和HLA-DR-FITC 的抗體振蕩混勻，每份樣品的采集細胞數≥104個，Cell Quest 軟件進行表型分析。同型對照抗體為相應的熒光素標記的小鼠IgG。制備第3 代hAMSCs 爬片，進行免疫組化染色檢測波形蛋白。

1.2.2 模型制備 大鼠用7%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 ml/100 g)，固定于大鼠腦立體定位儀上，按Leaver 等［10］方法，參照大鼠腦立體定向圖譜確定右側前腦內側束(medial forebrain bundle，MFB)坐標:前囟后4.6 mm，矢狀縫左側1.2 mm，顱骨骨膜下8.2 mm。用微量注射器3μl 6-OHDA(0.1% Vit C 臨用前配制，濃度4 μg/μl)注入MFB，注射速度1 μl/min，留針15 min，退針速度為1 mm/min。建模后1 w，腹腔注射多巴胺受體激動劑APO 0.5 mg/kg(0.1% V it C 生理鹽水臨用時配制)誘導旋轉，每周1 次連續4 w。若每次大鼠均以損毀側下肢為支撐點向健側(左側)旋轉，而且30 min 內平均旋轉次數超過7 轉/min，視為造模成功［11］。假手術組以生理鹽水代替6-OHDA，其余操作同模型組。

1.2.3 實驗分組與細胞移植 PD 模型大鼠隨機分為模型組(model)、hAMSCs 原位移植組(in situ)和舌下靜脈移植組(in vein)，另設假手術組(sham)作為對照，每組10 只。取第3 代hAMSCs 用不含血清的L-DMEM 培養基懸浮，原位移植組于造模注射位點注射8 μl hAMSCs 懸液(含3×105個細胞)，模型組同步注射等體積L-DMEM 培養基，靜脈移植組注射的細胞數同原位移植組。

1.2.4 行為學觀察 細胞移植后各組PD 大鼠每周定時腹腔注射APO(0.5 mg/kg)誘導PD 樣癥狀，待大鼠旋轉穩定后，攝像記錄5 min 內大鼠旋轉次數。連續誘導、觀察10 w。

1.2.5 hAMSCs 存活及分化檢測 分別于hAMSCs 移植后2 w 和12 w 每組取5 只大鼠，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，經心插管依次用生理鹽水和4%多聚甲醛后，取腦組織置于4%多聚甲醛4 ℃固定，梯度蔗糖脫水，原位移植區連續冰凍切片，片厚20 μm。切片經通透、封閉，滴加MAB1281 和MAP-2 抗體混合液4℃孵育過夜，用PBS 替代一抗作為對照。滴加PE 標記的羊抗小鼠IgG(針對MAB1281)與FITC 標記的羊抗兔IgG(針對MAP-2)混合液，DAPI 復染，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 酪氨酸羥化酶免疫組化染色 冰凍切片3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS 漂洗，滴加TH 抗體(1∶300 稀釋)，4 ℃孵育過夜，PBS 漂洗，DAB 顯色，沖洗，光學顯微鏡下觀察。

1.2.7 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，數據以±s 表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hAMSCs 形態及表型特征 hAMSCs 呈典型的貼壁生長特性，形態呈成纖維樣，呈放射狀或旋窩狀生長(見圖1A)。第3 代hAMSCs 表達間充質標志波形蛋白(見圖1B)。流式細胞術分析結果顯示，第3 代hAMSCs 幾乎不表達CD34、CD19、CD14、CD45、CD80、CD86 和 HLA-DR，高表達 CD73、CD44、CD90 和CD105(見圖2)。

圖1 hAMSCs 形態

圖2 hAMSCs 流式細胞術表型分析

2.2 hAMSCs 移植后PD 大鼠行為學變化 假手術組無1 例出現旋轉行為。hAMSCs 原位移植組和舌下靜脈移植組大鼠于移植后2 w 開始旋轉次數均明顯減少(均P＜0.05);至8 w，原位移植組大鼠旋轉次數仍明顯低于模型組(均P＜0.05)，而靜脈移植組旋轉次數6 w 則開始反彈，至7 w 已與模型組無明顯差異(見圖3)。

圖3 hAMSCs 移植后PD 大鼠行為學變化

2.3 hAMSCs 在腦內存活與分化 hAMSCs 移植后2 w 和12 w，原位移植組移植區腦組織均可見人細胞核特異性抗原陽性細胞(呈紅色熒光)，其中部分陽性細胞表達MAP-2(呈綠色熒光)。靜脈移植組以上兩個時間點均未檢測到人細胞核特異性抗原陽性細胞(見圖4)。

圖4 hAMSCs 原位移植后表達MAP-2(免疫熒光染色，×400)

2.4 酪氨酸羥化酶的表達 hAMSCs 移植后2 w，原位移植組大鼠黑質紋狀體TH 表達為強陽性，靜脈移植組為弱陽性，假手術組為強陽性，模型組無明顯TH 表達。至移植后12 w 可見原位移植組和靜脈移植組表達均下調(見圖5)。

圖5 各組大鼠黑質酪氨酸羥化酶的表達(免疫組化染色，×40)

3 討論

MSCs 的分離、培養和鑒定是移植過程中重要的質控環節。本實驗采用胰蛋白酶-膠原酶消化法分離，并通過貼壁培養純化的第3 代hAMSCs 不表達CD14、CD19、CD34、CD45 和HLA-DR，高表達CD44、CD73、CD90 和CD105，完全符合國際細胞治療協會(International Society for Cellular Therapy，ISCT)對MSCs 表型特征的界定［12］。實驗進一步顯示所分離hAMSCs 表達間充質標志波形蛋白，說明本實驗中用于PD 大鼠治療的hAMSCs 是典型的MSCs。

黑質DA 能神經元缺失是PD 主要的病理學特征。目前公認的PD 造模方法主要有兩種:一種是經靜脈或腹腔注射神經毒素MPTP 誘導建模;一種是于黑質紋狀體或MFB 注入甲腎上腺素同系物6-OHDA 建立偏側PD 模型［13］。這兩種方法均可造成黑質DA 能神經元損毀。相對于前者而言，盡管后者操作難度較大，但細胞損傷嚴重，由此產生的偏側旋轉等一系列類似于人類PD 癥狀和特征性病變穩定、持久［14］，更適合于較長時間的治療實驗觀察。MFB是通過下丘腦外側區的一束神經纖維，連接隔區、下丘腦和中腦的被蓋部位，黑質致密部的DA 神經元的軸突可以通過MFB 投射到紋狀體。本實驗采用單側MFB 注射6-OHDA 建立PD 大鼠模型，行為學動態觀察顯示，hAMSCs 原位移植組和舌下靜脈移植組大鼠于移植后，2 w 開始旋轉次數均明顯減少;原位移植組大鼠行為學改善可維持至移植后8 w，而靜脈移植組則只能維持至5 w。蔡哲等［15］報道hAMSCs 紋狀體內移植后2 w，MPTP 誘導的PD 模型小鼠的運動行為有明顯改善。本室早先的研究證明，hAMSCs 側腦室移植可促進實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型大鼠病損神經組織的修復和改善運動功能［16］。還有報道，hAMSCs 靜脈移植能改善阿爾茨海默病轉基因小鼠的學習記憶能力［17］。這些研究結果表明，無論hAMSCs 原位移植還是靜脈移植，對中樞神經系統退行性或免疫性疾病均有明顯療效。本實驗結果顯示，盡管靜脈移植hAMSCs 對PD 模型大鼠行為學改善的效應不如病損原位移植持久，但從應用角度講，“無創”靜脈移植更簡便安全。目前有關hAMSCs 治療效應的檢測時點多為移植后4 w 內，最多為1 m［18］，其治療效應究竟能持續多久尚不清楚。本實驗連續10 w 的動態觀察發現，靜脈輸注3×105hAMSCs 的治療效應可維持5 w，原位移植可持續8 w，說明hAMSCs 治療具有較長的效應期。細胞治療的生物效應除取決于供體細胞生物學特性外，還受移植途徑、移植細胞數、宿主機能狀態、靶組織微環境、供體細胞在體內的命運等因素的影響。因此，進一步通過大動物疾病模型評價hAMSCs 量-效關系，以及靶組織微環境對hAMSCs 效應的反饋影響很有必要。

hAMSCs 在異基因宿體體內的存活、歸巢、分化是學科界關注的重要問題。一般對hAMSCs 移植在宿主體內存活時間的觀察周期為2～4 w，最長不超過6 w［18，19］。本實驗觀察到原位移植后12 w，移植區腦組織仍可見人細胞核特異性抗原陽性細胞，說明hAMSCs 在宿主靶組織至少可存活12 w。值得提出，本實驗在未使用任何免疫抑制劑的情況下，hAMSCs 在大鼠體內存活較長時而不被排斥，說明hAMSCs 在異基因個體間移植具有良好的免疫豁免特性。表型分析結果顯示，hAMSCs 不表達HLADR，也不表達共剌激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)。也許正是這樣的免疫表型特征賦予了hAMSCs的免疫豁免特性。本實驗中未發現靜脈移植組腦組織中有hAMSCs 存活的證據，這可能與舌下靜脈移植后大量hAMSCs 滯留于肺組織有關［20］。體外實驗證明，hAMSCs 在特定的誘導條件下可分化為神經元、膠質細胞和少突膠質細胞［21］。MAP-2 主要表達于成熟神經元的胞漿和樹突。本實驗發現原位移植區部分人細胞核特異性抗原陽性細胞表達MAP-2，提示原位移植的hAMSCs 可分化為DA 能神經元樣細胞。TH 既是多巴胺合成的限速酶，也是DA 能神經元特異性標志之一，黑質TH 含量和活性降低及由此導致的DA 匱乏是PD 發病的主要環節［22］。實驗進一步觀察到模型組黑質紋狀體無TH 表達，而原位移植組則明顯表達，靜脈移植組也有弱表達。提示hAMSCs 改善PD 模型大鼠運動行為可能與其促進黑質TH 表達有關。

關于hAMSCs 移植治療神經損傷的機制尚不明確。一種推測是hAMSCs 移植到宿主體內沒有歸巢到病變部位，而是通過旁分泌機制修復病損神經組織;另一種推測是供體細胞移植或歸巢到宿主受損神經，在靶組織微環境誘導下分化為神經細胞進行補償性修復。已有研究提示，無論hAMSCs 是否定植于靶組織，通過旁分泌機制產生神經營養/調節因子、抑炎因子等可性溶性因子在促進病損神經組織的修復中都起著重要作用［8，23］。至于由hAMSCs 分化而來的神經元樣細胞能否起到對病損部位神經元缺失的補償，并重建新的神經環路，目前還缺乏證據，值得深入研究。

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