脂多糖誘導血腦屏障破壞中JNK 信號通路與基質金屬蛋白酶-9 作用機制的研究

覃蘭惠，黃 文，莫雪安，陳艷蘭，巫相宏

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時血腦屏障(BBB)完整性被破壞，在血管源性腦水腫發(fā)生發(fā)展中有重要作用。緊密連接是血管內皮細胞間主要的連接方式之一，BBB 的破壞與緊密連接結構、功能的改變密切相關，因此，闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時緊密連接破壞及其調控機制具有十分重要的臨床意義。LPS 是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，是重要的炎性致病因素。本課題以hCMEC/D3 體外培養(yǎng)作為BBB 的模型，觀察LPS 對BBB 緊密連接Occludin、ZO-1 的影響，探討其與JNK 信號通路及MMP-9 的關系，進一步闡明中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的發(fā)病機制，進而為臨床防治提供新的思路和科學依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 試劑與材料 四甲基偶氮唑鹽(MTT)(北京索來寶公司)，內皮細胞培養(yǎng)基(EBM-2)(Lonza 公司)，鼠膠原蛋白(R＆D Systems 公司)，胎牛血清(Hycolon 公司)，BCA 蛋白試劑盒(碧云天生物技術研究所)，Occludin 抗體(Life Techonology)，ZO-1 抗體(Epitomics 公司)，LPS、SP600125(Sigma公司)，phospho-JNK 抗體、總JNK 抗體(Cell Signaling Techonology)，GAPDH 內參蛋白抗體(Proteintech 公司)，SB-3CT(Selleckchem 公司)，TRIZol(life Techonology)，逆轉錄試劑盒、Taq PCR Master Mix kit(Takara 公司)。

1.2 實驗細胞及其培養(yǎng) hCMEC/D3 來源于人腦血管內皮，由法國Paris V 大學Pierre-Olivier Couraud 教授惠贈。將hCMEC/D3 經(jīng)胰酶消化后種植于鼠膠原蛋白包被過的培養(yǎng)瓶內，加入3～5 ml EBM-2 完全培養(yǎng)基(含有5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素、1.4 μm 氫化可的松、5 μg/ml 抗壞血酸、1% 脂質濃縮液、10 mmol/L HEPES，1 ng/ml bFGF)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基的顏色及細胞生長情況，1～2 d 換液1 次，待細胞融合至80%以上即傳代。

1.3 實驗分組及處理

1.3.1 LPS 和SP600125 對細胞活力影響的檢測 用不同濃度的LPS(0、1、10、50、100 μg/ml)和不同濃度的SP600125(0、0.11、0.22、2.20、4.40、11.00 μg/ml)處理hCMEC/D3 細胞24 h，四甲基偶氮唑鹽(MTT 法)檢測細胞活力。

1.3.2 LPS 對緊密連接Occludin、ZO-1 蛋白表達影響的檢測 用不同濃度LPS(0、1、10、50、100 μg/ml)處理hCMEC/D3 細胞24 h，分別收集細胞提取細胞總蛋白，以蛋白免疫印跡法(Western blot 法)檢測Occludin 和ZO-1 蛋白的表達。

1.3.3 LPS 對hCMEC/D3 細胞JNK 磷酸化水平影響的檢測 用LPS 10 μg/ml 分別處理hCMEC/D3 細胞0、15、30、60、120、240 min，分別收集細胞提取細胞總蛋白，以Western blot 法檢測總JNK(total JNK)及磷酸化JNK(phospho-JNK)的表達。

1.3.4 阻斷JNK 信號通路對LPS 誘導hCMEC/D3 的JNK 磷酸化水平、Occludin 和ZO-1 蛋白及其mRNA 表達的影響 實驗分4 種處理hCMEC/D3 細胞組:空白對照組、LPS 處理組、抑制劑SP600125 干預組、抑制劑SP600125 干預+LPS 處理組，分別收集細胞提取細胞總蛋白及總RNA，以Western blot 法檢測total JNK、phospho-JNK、Occludin和ZO-1 蛋白的表達;用Quantitative Real Time-PCR(qRT-PCR)法測定Occludin、ZO-1 mRNA 的表達。

1.3.5 抑制MMP-9 活性對LPS 誘導hCMEC/D3 細胞的Occludin 蛋白表達的影響 實驗分4 種處理hCMEC/D3 細胞組:空白對照組、LPS 處理組、抑制劑SB-3CT 干預組、抑制劑SB-3CT 干預+LPS處理組，用Western blot 法檢測Occludin 蛋白的表達。

1.3.6 阻斷JNK 信號通路對LPS 誘導hCMEC/D3 的MMP-9 mRNA 表達的影響 實驗分4種處理hCMEC/D3 細胞組:空白對照組、LPS 處理組、抑制劑SP600125 干預組、抑制劑SP600125 干預+LPS 處理組，分別收集細胞提取細胞總RNA，用qRT-PCR 法測定MMP-9 的mRNA 的表達。

1.4 MTT 法檢測細胞活力 待細胞貼壁生長至對數(shù)生長期時，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，將細胞懸液以每孔1×104細胞接種于96 孔板，每組取6個培養(yǎng)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，細胞貼壁呈單層生長。以不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后，用不同濃度的LPS(0、1、10、50、100 μg/ml)和不同濃度的SP600125(0、0.11、0.22、2.20、4.40、11.00 μg/ml)處理hCMEC/D3 細胞，培養(yǎng)24 h 后每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液。加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，振蕩10 min 使結晶充分溶解。用酶標儀測定吸光度值(波長570 nm)，以間接反映細胞活力。每組實驗結果取至少5 個復孔均值作為一次獨立實驗結果，取3 次獨立實驗結果做統(tǒng)計學分析。

1.5 Western blot 法檢測Occludin、ZO-1 蛋白、total JNK、phospho-JNK 的表達量 將hCMEC/D3 接種于6 孔板，按照實驗方案處理后，用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，4 ℃12000 r/min 離心15 min，收集上清液，BCA 蛋白定量試劑盒測量總蛋白濃度，每道上樣30 μg 蛋白，在10%或6%SDS 聚丙酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Occludin 一抗(1∶1500)、ZO-1 一抗(1∶2000)、內參GAPDH(1∶10000)、total JNK 一抗(1∶1000)、phopho-JNK 一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，次日用TBST 洗膜5 min×5 次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫搖床1 h，TBST洗膜5 min×5 次后進行增強化學發(fā)光反應，在暗室中顯影，沖洗膠片后掃描至計算機，用Image-J 圖像分析軟件對結果進行分析，以灰度值反映目的蛋白表達水平:以phospho-JNK 灰度值與total JNK 灰度值的比值反映JNK 磷酸化水平，以Occludin、ZO-1灰度值與內參GAPDH 灰度值的比值反映Occludin、ZO-1 相對表達量。每組實驗結果取至少3 張膠片灰度值均值作為一次獨立實驗結果，取3 次獨立實驗結果做統(tǒng)計學分析。

1.6 qRT-PCR 法測定Occludin、ZO-1 及MMP-9 的mRNA 表達量 用TRIzol 提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，應用ABI Prism 7300 序列檢測系統(tǒng)進行PCR 擴增，程序為:95 ℃預變性30 s，然后進行PCR 反應95 ℃5 s、60 ℃31 s，共進行40 個循環(huán)。引物序列分別為:Occludin:5’-TCAGGGAATATCCACCTATCACTTCAG-3’和5’-CATCAGCAGCAGCCATGTACTCTTCAC-3 ’;ZO-1:5 ’-GTGCCAGGAAGTTATACGAGCG-3’和5’-CACCATACCAACCATCATTCATTG-3 ’;MMP-9:5 ’-CGCTACCACCTCGAACTTTG-3’和5’-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3’;GAPDH:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’和5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。每組實驗結果取至少3 個復孔的均值作為一次獨立實驗結果，取3 次獨立實驗結果做統(tǒng)計學分析。以△△Ct法計算mRNA 相對表達。每個樣品通過管家基因GAPDH 作為內參使目標基因標準化。

2 結果

2.1 不同濃度LPS、SP600125 對細胞活力的影響 不同濃度LPS、SP600125 處理hCMEC/D3 細胞24 h 后，與空白對照組比較(分別為:0.21±0.003、0.18±0.01)，當LPS 濃度≥50 μg/ml(0.17±0.01、P＜0.01)、SP600125≥2.20 μg/ml(0.15±0.001、P＜0.001)時，對hCMEC/D3 細胞有明顯的抑制作用，且隨著濃度的增高，其對細胞活性的抑制作用增強(見圖1)。

2.2 LPS 對Occludin、ZO-1 蛋白表達的影響及其與JNK 信號通路的關系

2.2.1 不同濃度LPS 對緊密連接Occludin、ZO-1 蛋白表達的影響 見圖2，以不同濃度LPS 處理hCMEC/D3 細胞24 h，當LPS 濃度為1 μg/ml時，緊密連接Occludin(0.51±0.01、P＜0.001)和ZO-1(0.62±0.07、P＜0.001)蛋白表達水平較對照組(0.70±0.01、1±0.12)明顯下調，并且隨著LPS濃度的增大呈下降趨勢。

2.2.2 JNK 信號通路對LPS 誘導的緊密連接Occludin、ZO-1 蛋白及其mRNA 表達的影響 用抑制劑SP600125 阻斷JNK 信號通路，觀察LPS 誘導的緊密連接表達的變化。見圖3、圖4，以LPS(10 μg/ml)處理hCMEC/D3 24 h，LPS 組緊密連接Occludin 蛋白(0.51±0.01、P＜0.001)、ZO-1 蛋白(1.24±0.09、P＜0.05)和Occludin mRNA(0.88±0.02、P＜0.05)、ZO-1 mRNA(0.87±0.01、P＜0.01)水平較對照組(Occludin 蛋白0.93±0.02、ZO-1 蛋白1.37±0.07，mRNA 1±0.00)明顯下調。與LPS 組(Occludin 蛋白0.51±0.01、P＜0.001 及其mRNA 0.88±0.02、P＜0.05)相比，阻斷JNK 信號通路后可有效抑制LPS 下調緊密連接Occludin 蛋白(0.87±0.03、P＜0.001)及其mRNA(1.00±0.09、P＜0.05)的表達，然而阻斷JNK 信號通路對LPS 誘導的ZO-1蛋白(1.14±0.06、P＞0.05)及其mRNA(0.81±0.03、P＞0.05)的表達與LPS 組相比差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 MTT 法檢測不同濃度LPS、SP600125 對hCMEC/D3 細胞活力的影響(n=6，F(xiàn)A=19.35，F(xiàn)B=295.47)，與對照組相比，* P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

圖2 Western blot 法檢測LPS 對緊密連接Occludin、ZO-1 蛋白表達的影響(n=3，F(xiàn)A=1245.80，F(xiàn)B=42.01)。與對照組相比* P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001

圖3 Western blot 法檢測JNK 通路抑制劑SP600125 對LPS 誘導的緊密連接Occludin、ZO-1 蛋白表達的影響(n=3，F(xiàn)A=29.25，F(xiàn)B=4.70)。與對照組相比，* P＜0.05，＊＊＊P＜0.001;與LPS 組相比，###P＜0.001

圖4 qRT-PCR 法檢測JNK 通路抑制劑SP600125 對LPS 誘導的緊密連接Occludin、ZO-1 mRNA 表達的影響(n=3，F(xiàn)A=4.90，F(xiàn)B=8.96)。與對照組相比* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與LPS 組相比，#P＜0.05

2.3 JNK 信號通路對LPS 誘導的MMP-9 表達的影響 以抑制劑SP600125 阻斷JNK 信號通路，觀察其對LPS 誘導的MMP-9 mRNA 的影響。10μg/mlLPS 處理hCMEC/D3 24h，LPS 組MMP-9 的mRNA 水平(1.59±0.03、P＜0.001)較對照組(1.00±0.00)明顯升高。與LPS 組相比，阻斷JNK 信號通路后(0.77±0.08、P＜0.001)可顯著抑制此效應(見圖5)。

圖5 qRT-PCR 法檢測JNK 通路抑制劑SP600125 對LPS 誘導的MMP-9 mRNA 表達的影響(n=3，F(xiàn)A=96.09)。與對照組相比，＊＊＊P＜0.001;與LPS 組相比，###P＜0.001

2.4 LPS 對細胞JNK 磷酸化水平的影響及SP600125 的抑制效應 細胞在LPS 刺激15 min 后，JNK 磷酸化水平(0.76±0.10、P＜0.01)較對照組(0.46±0.01)明顯升高，30 min～1 h 稍有下降后再次上升(見圖6A)。而此效應可被SP600125(0.50±0.11、P＜0.05)所抑制(見圖6B)。

2.5 抑制MMP-9 活性對LPS 誘導的Occludin蛋白表達的影響 用MMP-9 抑制劑(SB-3CT)預處理細胞，觀察其對LPS 誘導的Occludin 蛋白表達的變化。10μg/ml LPS 處理細胞24h，LPS 組Occludin蛋白(0.30±0.03、P＜0.001)較對照組(0.57±0.05)明顯下調。與LPS 組相比，抑制MMP-9 活性可顯著增加Occludin 蛋白(0.53±0.06、P＜0.01)的表達(見圖7)。

圖6 Western blot 法檢測LPS 對細胞JNK 磷酸化水平的影響及SP600125 的抑制效應(n=3，F(xiàn)A=5.41，F(xiàn)B=6.58)。與對照組相比，* P＜0.05;＊＊P＜0.01，;與LPS 組相比，#P＜0.05

圖7 Western blot 法檢測MMP-9 抑制劑SB-3CT 對LPS 誘導的Occludin 蛋白表達的影響(n=3，F(xiàn)A=15.89)。與對照組相比，＊＊＊P＜0.001;與LPS 組相比，##P＜0.01

3 討論

血腦屏障由血管內皮細胞及其細胞間的緊密連接、基底膜以及毛細血管基底膜外的星形膠質細胞終足構成，其中血管內皮細胞及其細胞間的緊密連接是血腦屏障重要的形態(tài)學基礎［1］。本實驗選取人腦微血管內皮細胞(hCMEC/D3)為研究對象，由法國Pierre-Olivier Couraud 教授從成年人腦微血管分離而得，具有分化良好、可穩(wěn)定表達緊密連接蛋白的功能，是研究人BBB 的功能、觀察腦內皮細胞對炎癥反應的理想細胞［2］。緊密連接主要由復雜的跨膜蛋白(包括連接黏附分子、Occludin、Claudins)和胞質附著蛋白(包括ZO-1、ZO-2、AF-6、7H6)連接actin 骨架蛋白共同組成［3］。其中Occludin、ZO-1 在血腦屏障維持正常功能中具有關鍵作用，已有研究提示Occludin 和ZO-1 的破壞與內皮細胞通透性關系密切，缺氧、缺血再灌注可誘導Occludin 表達量或位置分布改變以及ZO-1 的表達量減少進而導致BBB 通透性增加［4，5］;Sheth 等研究發(fā)現(xiàn)LPS 可誘導腸上皮及膽管上皮細胞Occludin 和ZO-1 蛋白的破壞［6，7］。但研究多集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的內皮細胞的研究，關于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時血腦屏障緊密連接破壞的機制研究較少。

文獻報道中關于LPS 及SP600125 處理細胞濃度范圍波動較大，為了了解LPS 及SP600125 對本研究對象hCMEC/D3 細胞活性的影響，本實驗采用MTT 法檢測，結果顯示，在 LPS≤10 μg/ml、SP600125≤0.22 μg/ml 時對hCMEC/D3 細胞活性無明顯影響，因此，在本研究中取LPS 為10 μg/ml和SP600125 為0.22 μg/ml 進行實驗的細胞處理，排除了LPS 和SP600125 本身對hCMEC/D3 細胞的活性影響所可能造成的實驗干擾。

本研究結果可見，不同濃度LPS(1 μg/ml、10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml，見圖2)處理hCMEC/D3 后Occludin 和ZO-1 蛋白表達量均下降，與對照組比較具有統(tǒng)計學意義。表明LPS 可以下調hCMEC/D3 細胞間緊密連接Occludin 和ZO-1 蛋白的表達。Occludin 是緊密連接中重要的膜蛋白分子，直接決定了細胞對不同離子和大分子的通透性［8］。Occludin 的表達水平可代表BBB 的結構狀態(tài)，其下降程度可作為BBB 損傷程度的標志［4］。而Occludin 定位于緊密連接又必須依賴于胞質附著蛋白ZO-1［9］。ZO-1 屬于膜相關鳥苷酸激酶蛋白，含特殊的亮氨酸鋅指樣結構，在維持上皮細胞極性、細胞骨架的形成和構成細胞緊密連接中均起到了重要的作用。Occludin 和ZO-1 表達水平降低反映BBB的結構和功能的完整性受損，BBB 通透性增加［10］。本實驗顯示LPS 下調hCMEC/D3 的Occludin 和ZO-1 蛋白的表達，提示LPS 以此來破壞hCMEC/D3 緊密連接，從而破壞BBB。

然而，LPS 破壞人BBB 的調控機制尚未完全闡明。一些信號通路可能參與BBB 緊密連接表達的調控，其中JNK 信號通路是正常與疾病狀態(tài)時腦血管內皮細胞的一個重要調節(jié)靶點，該靶點可受多種細胞外因素的刺激而啟動，廣泛參與細胞凋亡、增殖、代謝及DNA 損傷修復等多種生物學反應。但尚未見有關JNK 通路是否參與LPS 誘導BBB 緊密連接破壞的報道，更無關于這條通路在哪個水平調節(jié)LPS 誘導BBB 緊密連接破壞的報道。SP600125 是JNK 信號通路抑制劑，通過與c-jun 競爭ATP 抑制JNK 磷酸化，從而阻斷JNK 信號通路。本研究證實，hCMEC/D3 細胞經(jīng)LPS 處理后，其JNK 磷酸化水平明顯升高(見圖6A);加入SP600125 可抑制JNK 磷酸化(見圖6B);用SP600125 預處理細胞后，可觀察到LPS 對Occludin 蛋白及其mRNA 的下調作用明顯減輕(見圖3A、4A)。顯示抑制JNK 磷酸化可以明顯改善LPS 對Occludin 蛋白及其mRNA的破壞，表明JNK 信號通路在LPS 下調Occludin 的表達中起重要作用，該作用可發(fā)生于蛋白和基因轉錄水平。由此推斷，LPS 刺激hCMEC/D3 后，使JNK磷酸化并具有酶催化活性，并從胞漿迅速移位至細胞核，啟動下游轉錄因子，從而調節(jié)Occludin 蛋白及其基因的表達。但是，用SP600125 阻斷JNK 信號通路，對LPS 誘導ZO-1 蛋白及其mRNA 的下調無明顯改善作用(見圖3B、4B)，提示LPS 對ZO-1 表達的的影響可能通過其他信號通路實現(xiàn)，有待進一步的探討。

本研究顯示LPS 處理hCMEC/D3 可誘導MMP-9 mRNA 的高表達(見圖5)，用SB-3CT 特異性抑制MMP-9 活性后可顯著改善LPS 下調Occludin 表達的作用(見圖7)。提示LPS 下調Occludin 的表達可能與MMP-9 的異常表達有關。MMP-9 屬于依賴Zn2+活性的蛋白質水解肽鏈內切酶，在正常發(fā)育、傷口愈合以及各種病理過程中發(fā)揮重要作用。我們既往研究發(fā)現(xiàn)HIV 感染的單核細胞與hCMEC/D3 共培養(yǎng)通過增加MMPs 的活性顯著下調JAM-A、Occludin 和ZO-1 蛋白表達［11］。也有研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后MMP-9 的表達上調［12，13］。炎性細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)很大程度上受組織中MMP-9 表達含量的影響［14］。

在正常腦組織中MMP-9 表達水平較低，其表達受到多種生長因子及細胞因子的調節(jié)，而這些因子通常可以通過激活細胞內的MAPK 信號通路來發(fā)揮其作用［15］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，Ras-ERK 和PI3K-Akt 信號通路參與調節(jié)MMP-9 的活性［16］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，用SP600125 預處理細胞后，可顯著降低LPS 誘導MMP-9 mRNA 高表達的作用(見圖5)，提示JNK 信號通路參與調節(jié)MMP-9 mRNA 的表達。結合抑制MMP-9 活性可顯著改善LPS 誘導的Occludin 表達下調的結果，表明LPS 誘導緊密連接Occludin 表達的下調可能與其引起MMP-9 的高表達有關，而該過程可能受JNK 信號通路調控。JNK 磷酸化可以促進其轉錄因子c-Jun 的形成，c-Jun 可以結合到許多基因啟動子區(qū)轉錄激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)位點，增加特定基因的轉錄活性。在MMP-9 啟動子中包含2 個AP-1 位點，有研究顯示減少AP-1 可以顯著抑制MMP-9 的表達，而在AP-1 復合物形成中c-Jun 發(fā)揮關鍵的作用［17］。因此我們推測，LPS 對BBB 的破壞，可能通過激活JNK 信號通路使其磷酸化，活化的c-Jun 進一步激活下游MMP-9 啟動子區(qū)AP-1 位點，促進MMP-9 的復制和轉錄導致其過度表達，進而降解緊密連接蛋白及細胞基質從而導致BBB 破壞。

綜上所述，LPS 可誘導緊密連接Occludin、ZO-1蛋白的下調導致血腦屏障破壞;本實驗研究在國內首次證實，LPS 可通過激活JNK 信號通路，調節(jié)hCMEC/D3 細胞緊密連接Occludin 的蛋白和mRNA表達，而對ZO-1 蛋白和mRNA 表達的影響可能通過其他信號通路實現(xiàn);LPS 誘導的緊密連接Occludin 蛋白的下調可能與MMP-9 的異常表達有關，JNK 信號通路可能參與了此過程的調控。

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