還原法與離子液體溶解法制備羊毛角蛋白膜

張 恒，李 戎，王 魁，菅應凱，馬吉宏

(東華大學國家染整工程技術研究中心，上海 201620)

還原法與離子液體溶解法制備羊毛角蛋白膜

張 恒，李 戎，王 魁，菅應凱，馬吉宏

(東華大學國家染整工程技術研究中心，上海 201620)

為提高羊毛角蛋白的提取率和應用性能，采用離子液體和羊毛預處理-還原C法2種途徑溶解羊毛，并且通過不同方法獲得再生羊毛角蛋白膜，對比了2種方法得到的再生角蛋白的性能和溶解率。研究發現利用改進的還原C法提取角蛋白，羊毛溶解率超過86%。再生角蛋白膜的紅外測試結果表明，離子液體溶解再生羊毛角蛋白膜分子的部分二硫鍵被氧化而斷裂;X射線衍射測試結果表明，離子液體溶解法所獲取的再生羊毛角蛋白膜分子構象由α-螺旋結構轉變成β-折疊結構，而改進的還原C法再生羊毛角蛋白膜保留了部分α-螺旋結構。

羊毛;角蛋白膜;離子液體;還原C法

羊毛纖維是一種性能優良的天然蛋白質紡織材料，并且已經證明羊毛中含有20多種氨基酸，它們聚集連接成為梯狀的多肽鏈［1］。這種多相的成分賦予羊毛優于棉類等天然纖維的高強物理化學性能。

羊毛中含有大量角蛋白，角蛋白是一種纖維狀蛋白質，存在于羽毛、頭發、趾甲和一些上皮覆蓋物中，具有柔韌和穩定的結構，是一種性能優良的生物高分子材料，因此，羊毛是一種實用價值很高的角蛋白資源［2－3］。角蛋白富含氨基酸，是一種純天然材料且與人體皮膚同屬一類蛋白質，角蛋白大分子常在醫療衛生方面應用，如可用作創傷面的保護層，也可用作人體軟組織的填充材料，同時還可作為其他細胞或組織的培養載體［4］。

角蛋白質的溶解技術是羊毛等角蛋白質資源回收再利用的前提和基礎，直接影響到后續的應用。羊毛溶解的理想目標是保持大分子主鏈完整的前提下，不破壞角蛋白大分子結構，同時最大程度地打開分子間的橫向聯系，最終得到高分子質量的角蛋白質溶液。目前，國內外溶解的方法基本可歸納為:酸堿性法［4］、金屬鹽法［4］、氧化法［5］、還原法(包括 A、B、C 3 種)［6］和離子液體法［2，7－8］等。還原法是在堿性條件下，利用還原劑將二硫鍵(—S—S—)還原成巰基(—SH)，從而將角蛋白溶解，最終獲取角蛋白溶液的方法。離子液體是以其不揮發、對水和空氣穩定，對無機、有機化合物以及高分子材料具有良好溶解性的性能而成為近年來新興的一類極具應用前景的環保型溶劑，其應用領域涉及電化學、有機合成、化工分離、材料制備等領域。近年來，離子液體對天然纖維的溶解再生引起了研究者的關注。

本文采用改進的還原C法和離子液體對羊毛纖維溶解，并應用不同方法再生了羊毛角蛋白膜。通過FT-IR、XRD、SEM對再生羊毛角蛋白分子結構進行表征，比較了2種方法的溶解率。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與設備

材料:羊毛角蛋白纖維(寧波利華羊毛工業股份有限公司);亞硫酸氫鈉(分析純);脲(分析純);十二烷基磺酸鈉(分析純);硫脲(分析純);氯化1-烯丙基-3-甲基咪唑(AR 99%);甲酸(AR 99%);甲醇(分析純);乙醇(分析純);凈洗劑LR-2(工業級，上海漢達染整有限公司)。

設備:101A-2E電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司);Hei-Standard數顯磁力加熱攪拌器(MR德國海道爾夫Heidolph有限公司);FA104分析天平(上海精科天平);RY-25012震蕩染色機(上海龍靈電子科技有限公司);球形脂肪抽出器(上海禾汽化工科技有限公司);YKHQ-5200DB超聲波儀(上海遠懷化工科技有限公司)。

測試儀器:Eclipse E400 POL實驗室偏光顯微鏡(日本尼康有限公司);D/max-2550 PC型X射線衍射儀(日本 Rigaku公司);傅里葉紅外光譜儀ATR(FT-IR-Raman NEXUS-670型配有SMART iTR金剛石附件);Quanta-250環境掃描電子顯微鏡(ESEM，捷克FEI)。

1.2 實驗過程

1.2.1 羊毛纖維的預處理

對羊毛進行清洗，工藝為:凈洗劑LR-2為8%;浴比20∶1，60℃，30 min。洗滌結束后取出羊毛用蒸餾水進行沖洗并干燥。干燥完畢后，取體積比為1∶1的乙醇和丙酮的混合溶液200 mL放入索氏提取器中，對一定量凈洗后的羊毛進行萃取脫脂12 h。

萃取脫脂結束后，用蒸餾水洗凈羊毛上殘留的乙醇和丙酮。在50℃下干燥1 h，重復清洗烘干，之后靜置12 h充分干燥。干燥結束后，將羊毛粉碎，長度大約在0.5cm左右。

1.2.2 離子液體中再生羊毛角蛋白膜

羊毛角蛋白/離子液體溶液體系的制備:稱取10.0g的離子液體［AMIM］+·Cl－，并加熱。當離子液體完全溶解為液體時，升溫至130℃。每次加入羊毛0.1 g，直至完全溶解再次加入，通過光學顯微鏡觀察羊毛是否溶解完全，并記錄溶解時間以及羊毛溶解質量。所有羊毛全部溶解后停止加熱，并將燒杯密封保存。

羊毛角蛋白膜的制備:將制取的羊毛角蛋白/離子液體溶液體系均勻地涂抹在載玻片上，涂抹厚度約在3～5mm左右。將載玻片置于培養皿中，并向培養皿中分別加入水、甲醇或者乙醇等凝固劑，直至凝固劑浸沒角蛋白膜。將培養皿密封，靜置6 h。將載玻片放入50℃的烘箱中烘干。取出載玻片，將附在載玻片上的羊毛角蛋白膜取下，放入密封袋中保存以備測試分析。

1.2.3 還原C法再生羊毛角蛋白膜

羊毛纖維的還原C法溶解:取6 g亞硫酸氫鈉，40g尿素，15 g硫脲，1.2 g十二烷基磺酸鈉(SDS)加入到100 mL去離子水中攪拌進行溶解，加入5 g羊毛粉末，共10份，放入振蕩機中，95℃溶解6 h，經過濾、離心處理，得到清澈的角蛋白溶液。

羊毛角蛋白的提取:將得到的澄清羊毛溶解液加熱至60℃以上，加入無水硫酸鈉，通過HCl溶液調節pH值至4.9左右(羊毛角蛋白等電點為4.5～5)，充分攪拌30 min后，離心處理，得到乳白色沉淀物質，用蒸餾水離心洗滌5次，凍干處理，得到白色粉末狀角蛋白。

羊毛角蛋白膜的制備:在室溫條件下，稱取1 g的羊毛角蛋白粉末，溶于甲酸溶液(99%)中，在密閉條件下攪拌溶解均勻。將羊毛角蛋白甲酸溶液體系均勻地涂抹在載玻片上，涂抹厚度約在3～5mm。將載玻片放到通風設備中，進行靜置處理，12 h之后取出載玻片，將附在載玻片上的角蛋白取下，放入密封袋中保存以備測試分析。

1.3 溶解率測試

將得到的溶液于轉數為8000 r/min離心12 min，得到的沉淀物于－52℃下冷凍并進行抽濾干燥，稱量，得到沉淀物的干態質量，并由此計算羊毛的溶解率。計算公式如下:

式中:S為羊毛的溶解率;W0為實驗中初始羊毛的干態質量，g;W1為未溶物烘干后的總干態質量，g。

實驗中羊毛溶解率比角蛋白提取率略大。

1.4 微觀結構表征

分別用FT-IR、XRD、顯微鏡、SEM等測試手段對羊毛纖維及其再生羊毛角蛋白膜進行表征。

2 結果與討論

2.1 羊毛角蛋白的溶解

溶解過程中羊毛角蛋白分子質量的大小與溶解時間有關，溶解時間越長，羊毛角蛋白分子鏈間的化學鍵被溶劑破壞得就越多［2，7］。利用顯微鏡對其溶解程度進行觀察，其結果如圖1所示。

由高分子溶解弗洛里-哈金斯晶格理論［8］可知，羊毛角蛋白粉末在液體中的溶解過程可分為3個階段:溶脹，滲入，溶解。即羊毛角蛋白粉末首先在溶液中溶脹，當溶脹達到一定程度以后，呈現出一定的間隙，溶劑小分子從外層逐漸向內層深入，使大分子間的物理結合力得到破壞(如分子間的范德華力和氫鍵作用力)，溶劑化作用也就逐漸進行，溶劑小分子的進入使得分子間間隙得到更大程度的溶脹，溶脹作用更加劇烈，隨溶劑化作用進行，其膨脹程度逐漸增大。即在溶解過程中，羊毛角蛋白分子的大分子鏈由于充分溶劑化而得到充分膨脹，物理作用力的大量破壞，使得在一起的分子鏈拆開互相的纏結而擺脫了彼此的束縛，最后自由地從高濃度向低濃度溶劑方向運動擴散，最終達到溶解。然后開始溶解，羊毛角蛋白纖維逐漸變細，直至完全消失。圖1示出羊毛角蛋白纖維在離子液體和還原C溶液中完全溶解。

羊毛角蛋白纖維在離子液體中，130℃，1%條件下，經過15 min已經趨向于完全溶解(圖1(a)中顏色較深的為未溶解的羊毛角蛋白)。而在還原C溶液中，95℃，10%的條件下，經過6 h，還有少許并不溶解的物質存在(圖1(b)中顏色較深的點狀物質)，推測這些物質可能是羊毛鱗片層結構中的不溶解部分。

圖1 羊毛角蛋白完全溶解后形態Fig.1 Images of wool keratin dissolved in 1%of wool keratin/［AMIM］+·Cl－，130 ℃，15 min(a)and 10%of Reduction C solution，95℃，6 h(b)

盡管離子液體溶解羊毛角蛋白的溶解速度快，但是能量要求較高，成本較高，離子液體回收比較繁瑣。羊毛角蛋白在還原C溶液中的溶解效率較高，適用于批量提取，有利于羊毛角蛋白的回收。

2.2 溶解率對比

表1示出不同溶解方法的溶解率。

表1 不同溶解方法的溶解率Tab.1 Solubility of different dissolution method

由表可知，還原C法溶解羊毛角蛋白纖維的溶解度比較大，并且經過預處理后的羊毛粉末溶解速率也比較快，傳統的還原C法(文獻［6］中優化過的還原法)需要時間(12 h左右)比較長，溶解率也比較低，溶解之后的角蛋白分子質量不易控制。但是本文中優化過的還原C法是先將羊毛前處理制備成粉末，與溶劑的接觸面積增大，更易于反應。盡管在離子液體溶解羊毛時間(20 min左右)比較短，但是溶解率遠遠低于還原C法。

2.3 羊毛角蛋白再生前后的紅外光譜分析

為研究羊毛角蛋白纖維與經不同處理的再生羊毛角蛋白膜的分子特性，將再生的羊毛角蛋白膜與羊毛纖維進行紅外光譜分析，圖2為羊毛纖維以及不同方法提取的再生羊毛角蛋白的紅外光譜(FTIR)圖。

圖2 羊毛纖維與不同方法提取的再生羊毛角蛋白的紅外光譜圖Fig.2 IR comparison of natural wool keratin fibers and regenerated wool

由圖2可看出，羊毛纖維的紅外圖譜的特征吸收峰與本文用不同方法處理的再生羊毛角蛋白膜的分子的紅外信號峰位置基本相同［7］。3290和2960cm－1處分別為O—H和 C—H伸縮振動峰。1700～1200cm－1內的譜峰對應于羊毛角蛋白酰胺鍵的特征峰，這說明羊毛角蛋白在溶解以及再生過程中分子結構未發生較大改變。

蛋白質酰胺Ⅰ的吸收峰約為1700～1600cm－1，主要由==C O的伸縮振動引起，蛋白質酰胺Ⅱ和蛋白質酰胺Ⅲ的吸收峰分別為1550cm－1左右和1300～1220cm－1范圍內，主要包括N—H的彎曲振動和==C N的伸縮振動［8］，但因為蛋白質的二級結構對酰胺Ⅰ的吸收峰影響較大，一般可用來確定蛋白質的二級結構［9］。對于α-螺旋構象，酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶的譜峰分別是:1660 ～1648cm－1、1550 ～1540cm－1和 1250 ～1235cm－1;對于 β-折疊，酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶的譜峰則分別是1640～1620cm－1、1540～1530cm－1和 1235 ～1220cm－1［9］。

從圖2中還可看出，天然羊毛纖維的紅外譜圖中在1660、1540和1244cm－1處有吸收峰，再生羊毛角蛋白的紅外譜圖中在1639、1530和1230cm－1處有吸收收峰，表明在羊毛角蛋白在提取過程中其分子構象由α-螺旋結構轉變成β-折疊結構。此外與天然羊毛角蛋白纖維相比，離子液體法所提取的羊毛角蛋白譜圖上多出1個約1150cm－1處峰，該峰對應于邦特鹽殘基S—O的不對稱伸縮振動峰，但是S—O鍵在羊毛角蛋白纖維中并不存在，可能是羊毛角蛋白纖維中 S—H 或—S—的氧化產物［2，9］，這表明羊毛角蛋白纖維在溶解過程中發生了氧化反應使部分二硫鍵被打破。

2.4 羊毛角蛋白膜的晶體結構分析

為能更好地了解羊毛角蛋白纖維降解機制，將羊毛角蛋白纖維和本文實驗經不同處理的再生羊毛角蛋白膜的分子結構進行X射線衍射表征，結果如圖3所示。

圖3 羊毛纖維與經不同方法處理的再生羊毛角蛋白膜的X射線衍射圖Fig.3 XRD comparison of wool keratin fibers and regenerated wool keratin coagulated by different solvents

如圖3所示，經不同方法處理的再生羊毛角蛋白膜分子的X射線衍射圖中都存在2θ為20.78°的峰，對應角蛋白反平行 β-折疊構象結構［10－11］。離子液體法獲取的角蛋白的譜圖中與α-螺旋構象對應的約10.10°處的峰變寬變平坦，并且經不同途徑再生處理后，峰位都向右移動，說明羊毛角蛋白纖維在溶解過程中α-螺旋結構被破壞，進一步驗證了紅外光譜的結論。

還原C法獲取的角蛋白膜的X射線衍射圖像中，2θ峰位與羊毛纖維類似。α-螺旋構象對應的10.10°的峰位向左平移，并且變寬變大，說明其構象保留了部分α-螺旋結構。

2.5 羊毛角蛋白膜的表面形態分析

為對比羊毛再生前后的表面形態變化，應用高倍率掃描電鏡(SEM)分析羊毛角蛋白纖維和再生羊毛角蛋白膜的結構，如圖4所示。

圖4 羊毛及再生角蛋白的SEM圖像Fig.4 SEM of various forms of nature wool keratin fiber and regenerated wool keratin films.(a)Nature wool keratin fiber(×1000);(b)Nature wool keratin fiber(×3000);(c)Regenerated wool keratin films(×1000);(d)Regenerated wool keratin films(×2000)

由圖4(a)、(b)可看出，羊毛角蛋白纖維是具有明顯鱗片層的纖維狀高分子材料，而從圖4(c)、(d)可看出再生羊毛角蛋白膜表面平整無殘留羊毛纖維結構，說明羊毛角蛋白纖維及其表面鱗片層在離子液體和還原C溶液中能被完全溶解，并且在這個再生過程中羊毛鱗片層結構已經不存在，形成了更細更致密的膜結構，此結構將賦予其新的物理化學性能及新的用途。

3 結論

通過對羊毛用不同方法進行溶解，再生，得到了再生角蛋白薄膜。從FT-IR中可發現，離子液體法以及還原C法獲得的角蛋白薄膜與羊毛纖維的基團位置基本相同，羊毛角蛋白分子結構未發生較大改變，都屬于典型的蛋白質類紅外光譜圖，但離子液體法處理得到的角蛋白薄膜蛋白質的二級結構所對應的酰胺鍵的特征峰發生改變。離子液體再生角蛋白膜1150cm－1處吸收峰，對應于邦特鹽殘基S—O的不對稱伸縮振動峰，S—O鍵在羊毛纖維中不存在，而是羊毛分子鏈中S—H或—S—的氧化產物。

通過X射線衍射分析發現，離子液體溶解法羊毛角蛋白構象由α-螺旋結構轉變成β-折疊結構，而還原C法再生角蛋白膜保留了羊毛纖維的部分α-螺旋結構。

對比溶解率發現，還原C法對羊毛纖維的溶解率高達87%，而離子液體的溶解率卻只有10%。

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Preparation of wool keratin membranes prepared by ionic liquid method and reduction C method

ZHANG Heng，LI Rong，WANG Kui，JIAN Yingkai，MA Jihong
(National Engineering Research Center for Dyeing and Finishing of Textiles，Donghua University，Shanghai201620，China)

In order to improve the extraction rate and application performance of wool keratin membrane，wool was dissolved by two methods including ionic liquids method and pretreatment-reduction C method(reduction C)，wool keratin membrane were regenerated through different channels，and the performance and dissolution rate of wool keratin membranes obtained by the two method were compared.Compared to ionic liquids method，the solubility of wool fibers by the pretreatment-Reduction C method is much higher，over 86%.It is indicated from the results of FT-IR that part of disulfide bonds was broken during the dissolution by ionic liquid.It can be seen from X-ray diffraction data that the regenerated membrane by ionic liquids method exhibited a β-sheet structure and the disappearance of the α-helix structure，while part of αhelix structure was remained if the keratin was dissolved by the pretreatment-Reduction C method.

wool fiber;keratin membrane;ionic liquid;reduction C method

TS 102.31

A

10.13475/j.fzxb.20140400106

2014－04－01

2014－09－03

十二五科技支撐計劃項目(2012BAK30B03)

張恒(1987—)，男，碩士生。主要研究方向為羊毛角蛋白的回收利用。E-mail:zhang_888heng@126.com。