苧麻水解液中單糖類組分的柱前衍生-高效液相色譜法檢測

馮湘沅，成莉鳳，段盛文，譚志堅，鄭 科，劉正初

(中國農業科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

苧麻纖維是我國的重要紡織原料［1］，其纖維化學成分主要為纖維素，同時含有半纖維素、果膠、木質素等伴生物，這些物質在適當條件水解后，變成甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖等單糖類組分，而各單糖類組分含量是最重要的基礎數據之一［2－3］。目前，對苧麻組成成分的分析方法僅限于單一法［4－5］，本文結合柱前衍生技術，探討了高效液相色譜法快速、準確地分離、鑒定與檢測苧麻水解產物中的單糖類組分及含量［6－8］，旨在為苧麻等草本植物纖維綜合開發利用研究［9］提供科學參考。

1 試驗部分

1.1 試驗材料與主要儀器

樣品1:湖南沅江基地種植的湘苧2號苧麻原麻。

樣品2:湖南長沙基地種植的圓青5號苧麻原麻。

試劑:乙腈(色譜純)、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖均為美國Sigma公司產品，醋酸銨(分析純)、1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸均為國藥集團化學試劑有限公司產品。

Dionex Ultimate 3000液相色譜儀，LPG-3400泵，VWD-3400紫外檢測器、Thermo Hypersil BDS C18 柱(250mm ×4.6mm，5 μm)，數據采集和圖譜處理采用變色龍軟件。

1.2 色譜條件

色譜柱:C18柱，紫外檢測器;柱溫為35℃;流動相V(0.1 mol/L醋酸銨緩沖溶液，pH值為5.5)∶V(乙腈)=81∶19;流速為 1.0 mL/min;波長為250 nm;進樣量為 20 μL。

1.3 苧麻水解

稱取苧麻樣品20 mg剪碎置于具塞試管中，加入三氟乙酸，于 110℃水解 3 h，冷卻至室溫，3000 r/min離心10 min，取水解產物上清液真空干燥。

1.4 單糖類衍生化

混合標準單糖類溶液配制:分別稱取甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖各18 mg，混合6種單糖類溶于7.5 mL濃度為0.3 moL/L的NaOH溶液中。

單糖類衍生:取75 μL混合標準單糖類溶液與50 μL PMP甲醇(0.5 mol/L)混合，70℃條件下反應30 min，冷卻至室溫，用75 μL濃度為0.3 mol/L的HCl中和，置真空干燥箱中干燥。加1 mL去離子水和1 mL三氯甲烷完全溶解干燥固形物，去除有機相(重復此步驟3次)。水相用0.45 μm濾膜過濾后，加去離子水稀釋至5 mL，進行高效液相色譜分析［10－11］。混合標準單糖類溶液使用時稀釋成所需濃度。

苧麻水解產物上清液經真空干燥后的固形物單糖類衍生方法同混合標準單糖類衍生方法。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

為使苧麻水解液中的單糖類有效分離，本文實驗分別采用甲醇與水、乙腈與水、K2HPO4-NaOH與乙腈以及醋酸銨緩沖溶液與乙腈作為流動相，通過多次不同配比選擇比較，當V(醋酸銨緩沖溶液)∶V(乙腈)=81∶19時分離效果最佳，各單糖類均獲得較好分離。利用該流動相分離的混合標準單糖類溶液色譜圖如圖1所示。

圖1 混合標準單糖類溶液色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of mixed standard monosaccharides

2.2 標準曲線繪制

將混合標準單糖類溶液分別稀釋 2、4、6、8、10倍進樣分析，以色譜峰面積(Y)為縱坐標，濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線，其各組分的線性回歸方程、相關系數、線性范圍見表1。結果表明，各單糖的線性相關系數為0.9996～0.9999，線性關系良好。

2.3 方法精密度試驗

取稀釋4倍的混合標準單糖類溶液重復進樣6次，測定儀器和方法的精密度，結果見表2。表中結果顯示，各單糖的相對標準偏差均在2.02%以下，說明本方法滿足精密度要求。

表1 6種單糖類線性回歸方程、相關系數及線性范圍Tab.1 Linear regression equation，relative coefficient and linearity range of six monosaccharides

表2 混合標準單糖類溶液測定精密度Tab.2 Precision of mixed standard monosaccharides

2.4 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品溶液，加入適量標準單糖類溶液，混勻，進樣分析，計算回收率，見表3。表中結果表明，6種單糖類的回收率為96.53% ～102.76%，符合儀器分析要求(95% ～105%)。同時，也說明使用該方法處理苧麻樣品，其單糖類含量損失少，誤差小。

表3 6種單糖類組分的回收率Tab.3 Recoveries for 6 standard monosaccharides

2.5 樣品含量的測定

取2個供試苧麻樣品各20 mg，通過三氟乙酸水解后，水解產物上清液干燥衍生化處理，濾渣干燥稱量，結果見表4。由表可知，經三氟乙酸處理，苧麻水解率可達90%，未被三氟乙酸水解的木質素等酸不溶性物質在10%以下，說明采用三氟乙酸水解苧麻的纖維素、半纖維素與果膠等生成單糖類物質是可行的。

表4 苧麻水解率測定結果Tab.4 Hydrolysis ratio for ramie

對供試苧麻樣品進行分離檢測，苧麻水解液單糖類組分色譜圖見圖2。根據混合標準單糖類溶液色譜圖及繪制標準曲線的各組分回歸方程計算，獲得苧麻水解產物的單糖類衍生物的含量見表5。結果表明，苧麻中的主要單糖類組分為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖，其中葡萄糖含量最高，占樣品1被水解已知單糖類物質總量(801.75 μg)的83.86%，占樣品2已知單糖類物質總量(679.12 μg)的86.54%。另外，還有占水解產物總量的少量未知組分。

圖2 苧麻水解液單糖類組分色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of monosaccharides in hydrolyzed ramie

表5 苧麻水解液單糖類含量測定結果Tab.5 Monosaccharides content of hydrolysed ramie

3 結論

本文研究利用柱前衍生-高效液相色譜法對苧麻水解產物中的單糖類組分進行了分析，檢測結果表明，采用三氟乙酸處理，能達到水解苧麻中纖維素、半纖維素及果膠等生成多種單糖物質的目的。苧麻水解液中的主要單糖類組分為甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖，其中，葡萄糖含量最高，在樣品 1為 672.32 μg，樣品 2中為587.74 μg，而甘露糖最低。通過樣品 PMP柱前衍生，實現了利用C18柱和紫外檢測器對苧麻水解液中單糖類組分的檢測，該方法具有線性關系良好、精密度高、回收率好等優點。另外，存在的未知組分有待于進一步分析。

［1］熊和平.苧麻多功能開發潛力及利用途徑［J］.中國麻作，2001，23(1):22 －25.XIONG Heping.The first of serial reports on multifunctional development and utilization in ramie-Thepotential with multi-functional development and the path of utilization in ramie［J］.China's Fiber Crops，2001，23(1):22 －25.

［2］冷鵑，程毅，肖愛平，等.苧麻化學成分微波快速測定［J］.中國麻業科學，2009，31(3):211－214.LENG Juan， CHENG Yi， XIAO Aiping， etal.Determine ramie chemical components by microwave rapid test method［J］.Plant Fiber Sciences in China，2009，31(3):211 －214.

［3］王成國，譚遠友，張尚勇.苧麻化學成分動態變化規律研究［J］.上海紡織科技，2008，36(1):15－19.WANG Chengguo，TAN Yuanyou，ZHANG Shangyong.Study on dynamic change regulation of ramie's chemical composition［J］. Shanghai Textile Science ＆Technology，2008，36(1):15 －19.

［4］張宏書，楊精千，蔡楚森.苧麻葡甘聚糖的提純和分析［J］.纖維素科學與技術，2002，10(1):1－7.ZHANG Hongshu，YANG Jingqian，CAI Chusen.The purification and analysis of ramie glucomanna［J］.Journal of Cellulose Science and Technology，2002，10(1):1－7.

［5］姜偉，韓光亭，張元明，等.基于近紅外技術的苧麻纖維素及膠質含量快速測定［J］.紡織學報，2012，33(1):6－10.JIANG Wei，HAN Guangting，ZHANG Yuanming，et al.Fast quantitative analysis of cellulose and gum content in ramie based on near-infrared technique［J］.Journal of Textile Research，2012，33(1):6 －10.

［6］周紅，楊祥良，張曉昱，等.半纖維素菌株發酵液中單糖及二糖的分析［J］.武漢化工學院學報，2002，24(4):17－19.ZHOU Hong，YANG Xiangliang，ZHANG Xiaoyu，et al.Analysis of mono-sacchrides and di-saccharides in semi-fiber fermentation liquor by high pressure liquid chromatography［J］.Journal of Wuhan Institute of Chemical Technology，2002，24(4):17 －19.

［7］方宏，曾健智，陳海珊，等.高效液相色譜法檢測蔗糖半纖維素水解物中的單糖［J］.廣西科學院學報，2000，16(3):124 －126.FANG Hong，ZENG Jianzhi，CHEN Haishan，et al.Analysis of monosaccharide compositions of semi-fiber cellilose by HPLC Method［J］.Journal of Guangxi Academy of Sciences，2000，16(3):124 －126.

［8］范剛，唐策，李艷，等.柱前衍生HPLC分析黃連多糖的單糖組成［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20(11):74－78.FAN Gang，TANG Ce，LI Yan，et al.Analysis of monosaccharide compositions of polysaccharides in coptidis rhizoma by pre-column derivatization HPLC method［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2014，20(11):74 －78.

［9］劉正初.用科學發展觀看我國草本纖維產業前景［J］.中國麻業科學，2007，29(增刊):68－71.LIU Zhengchu.Foreground analysis of herbaceous fiber industry with scientific development view in China［J］.Plant Fiber Sciences in China，2007，29(supplement):68－71.

［10］林雪，賈敬芬，黃琳娟，等.RP-HPLC用于蘆薈多糖的單糖組成研究［J］.食品科學，2006，27(4):192－195.LIN Xue，JIA Jingfen，HUANG Linjuan，et al.Study on the use of RP-HPLC in analysis of aloe polysaccharide composition［J］.Food Science，2006，27(4):192－195.

［11］姜彩霞，劉曉蘭，田英華，等.高效液相色譜法測定亞麻纖維果膠單糖衍生條件的優化［J］.毛紡科技，2014，42(10):1 －4.JIANG Caixia，LIU Xiaolan，TIAN Yinghua，et al.Optimization for precolumn derivatization of monosaccharide in flax fiber pectin by HPLC［J］.Wool Textile Journal，2014，42(10):1 －4.