COPD合并肺性腦病患者腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平變化及意義

周媛媛，曾凡軍，熊曉琦，阮玉姝，萬曉蓉，宋新宇

(三峽大學第一臨床醫學院宜昌市中心人民醫院，湖北宜昌443000)

肺性腦病是慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者嚴重的并發癥，病死率高達60%左右［1］。其發病機制尚未完全闡明，神經元自噬可能是其發病機制之一，β-葡糖腦苷酶(β-GBA)、Atg7、p62為神經元自噬相關標志物［2］。2012年1月～2014年1月，我們觀察了肺性腦病患者腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平變化，并探討其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宜昌市中心人民醫院收治的COPD合并肺性腦病者50例(觀察組)及單純COPD患者50例(對照組)，均符合中華醫學會呼吸病學會COPD診斷標準［3］;排除合并結核性胸膜炎、病毒或寄生蟲感染者，既往有中樞神經系統損害及惡性腫瘤患者。觀察組男33例、女17例，年齡(66.8± 6.3)歲;合并消化道出血2例、代謝紊亂8例。對照組男29例、女21例，年齡(67.2±7.1)歲;合并消化道出血1例、代謝紊亂2例。兩組基本資料具有可比性，患者或家屬簽署知情同意書，并經宜昌市中心人民醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 患者均行腰椎穿刺采集腦脊液，離心后采用ELISA法檢測β-GBA、Atg7蛋白，試劑盒購自美國SIGMA公司，按說明操作。Western blot法檢測p62蛋白:運用全蛋白提取試劑盒提取兩組細胞蛋白，－80℃凍存備用。10%的SDS-PAGE膠分離相應蛋白，采用濕法轉膜45 min，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入1∶1 000稀釋的兔抗人p62一抗，4℃孵育過夜，次日PBS洗膜后加入稀釋比例為1∶5 000的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗膜后行ECL發光。選用β-actin蛋白為內參蛋白對照，以蛋白灰度值表示其表達量。

1.2.2 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料用s表示，兩組比較用t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較，見表1。

表1 兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較(s)

表1 兩組腦脊液β-GBA、Atg7、p62水平比較(s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別 n β-GBA(pg/mL) Atg7(pg/mL)p62觀察組 50 34.6±6.8* 12.4±3.2*0.35±0.05對照組50 15.5±3.6 2.8±0.6 0.23±0.03

3 討論

COPD患者合并感染時常會出現低氧及CO2潴留，極易并發肺性腦病，患者常表現為淡漠、反應遲鈍、嗜睡、譫妄或昏迷等意識障礙。

肺性腦病發生、發展過程中，缺氧是核心因素。神經元缺氧可致自噬死亡或凋亡。長期以來，自噬被認為是神經元的一種保護性作用，在維持缺血、缺氧等應激狀態下細胞存活、清除細胞內衰老細胞器及錯誤折疊蛋白中起重要作用。近年發現，在某些條件下細胞自噬也能導致細胞死亡。自噬作為一種重要的物質代謝方式，它的發生受到嚴格的調節和控制。自噬的調控通路可分為mTOR調節途徑和mTOR途徑不依賴性調節途徑［4］。在缺血缺氧情況下，自噬的發生主要由mTOR途徑調控。p62與自噬密切相關，p62偶聯于微管相關蛋白輕鏈3，參與自噬體的構成，是一種調節因子，在自噬中、晚期會降解［5］。通常情況下，細胞內p62表達水平與自噬活性存在負相關。例如，在饑餓誘導的細胞自噬缺陷狀態下，Mizushima等［6］觀察到p62的蓄積。研究證實，細胞內p62的表達水平與多種自噬相關因子關系密切［7］，但細胞自噬不是p62惟一的降解途徑［8］。本研究發現，COPD合并肺性腦病患者，腦脊液中p62蛋白水平顯著增高，表明肺性腦病患者中樞神經元自噬增強。自噬增強有助于提高在缺氧及CO2潴留的病理狀態下，提高神經元對缺氧及高CO2致損傷的耐受力，起到一定的保護性效應。

β-GBA是一種水解酶，存在于溶酶體內。最初發現與戈謝病相關，基因突變導致β-GBA減少或缺乏，致使巨噬細胞內的葡萄糖腦苷脂不能被水解，蓄積在溶酶體中，導致細胞功能受到影響。隨后發現，β-GBA與帕金森病相關［9］。本研究發現，β-GBA與肺性腦病相關，肺性腦病患者，腦脊液中β-GBA水平升高。由于自噬與溶酶體相關，肺性腦病誘發的自噬效應，是否與β-GBA有直接或間接關系，尚需進一步研究。

目前，研究發現自噬體的形成至少需要16種Atg基因的參與。Atg1是第一個被成功克隆的自噬基因［10］，Atg1缺乏時自噬發生受到抑制［11］。Atg7是一種泛素E1樣連接酶，可以激活泛素樣蛋白Atg12和Atg8。Atg7可以激活哺乳動物中的所有3種Atg8，即GATE-16、GABARAP和LC3。自噬體的形成需要一個泛素樣連接體系，其中Atg12和Atg5共價結合，并定位到自噬體囊泡中。Atg7是泛素樣蛋白通路中位置上游的關鍵基因，為自噬泡形成的必需蛋白質分子［12］。有研究證實，在阻斷小鼠L929細胞中Atg7的表達后，可以顯著降低自噬性細胞死亡的發生率［13］。本研究發現，肺性腦病患者腦脊液Atg7水平顯著升高，可能是神經元損傷后部分神經元裂解后蛋白釋放到蛛網膜中。

綜上所述，COPD肺性腦病患者腦脊液β-GBA、Atg7、p62蛋白水平升高，而Atg7及其參與的泛素樣蛋白通路可能是肺性腦病患者神經元自噬發生的一條重要通路。通過這一研究，我們可更進一步了解肺性腦病神經元自噬發生的分子機制，從而為肺性腦病的診治尋找到新靶點。

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