大鼠腦橋呼吸調(diào)整中樞神經(jīng)元對低氧呼吸反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

汪慧，楊俊卿，槐瑞托

(山東科技大學(xué)，山東青島266590)

低氧呼吸反應(yīng)是指在低氧環(huán)境中呼吸運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性變化。在哺乳動(dòng)物，急性低氧導(dǎo)致雙相呼吸反應(yīng)，即起始階段的呼吸運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)并達(dá)高峰和隨后的逐漸減弱但持續(xù)高于常氧呼吸水平至低氧結(jié)束［1］，急性低氧刺激結(jié)束后，呼吸頻率即刻下降至低于低氧刺激前水平，此現(xiàn)象稱為低氧后呼吸頻率下降(PHFD)［2，3］。1923年Lumsden通過實(shí)驗(yàn)提出腦橋呼吸調(diào)整中樞的概念［4］。背側(cè)腦橋是傳統(tǒng)意義上的腦橋呼吸調(diào)整中樞，主要結(jié)構(gòu)是 KF核及 PB核［5～9］。研究表明，腦橋呼吸調(diào)整中樞對急性低氧引發(fā)的外周化學(xué)感受器反射的呼氣或頻率成份具有特異性影響［10，11］。2012年3月～2013年5月，我們系統(tǒng)觀察了大鼠背側(cè)腦橋N-甲基-D-天氡氨酸(NMDA)受體及γ-氨基丁酸(GABA)受體對低氧呼吸反應(yīng)的作用，為進(jìn)一步研究腦橋的呼吸調(diào)控功能提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量250～450 g。所有動(dòng)物手術(shù)過程和飼養(yǎng)方法符合世界腦研究組織發(fā)布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用條例。

1.2 主要試劑 NMDA受體阻斷劑D-2-氨基-5-磷酸基戊酸(D-AP5)和GABA受體阻斷劑荷包牡丹堿(BIC)均為美國Sigma公司產(chǎn)品，D-AP5及BIC溶于人工腦脊液，稀釋至10 mmol/L，注射劑量為20～50 nL。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備 30%的氨基甲酸乙酯(1.5 g/kg)腹腔麻醉，皮下注射阿托品(0.1 mg/kg)減少呼吸道內(nèi)腺體分泌，腹側(cè)頸部游離并切斷雙側(cè)迷走神經(jīng)及C5膈神經(jīng)。將神經(jīng)浸潤于液體石蠟中。股動(dòng)脈及股靜脈分別用于監(jiān)測血壓及靜脈給藥。三碘季銨酚(Sigma公司)肌松，氣管插管接呼吸機(jī)給予人工通氣。CO2監(jiān)測儀持續(xù)監(jiān)測終末呼出氣CO2分壓并使其維持在5%～5.5%。根據(jù)大鼠腦圖譜［12］，將動(dòng)物的頭部以俯臥位固定于立體定位儀上，使前囟高于后囟約1.5 mm以便于電極插入。切開后囟附近的皮膚及其他組織，暴露顱骨，在后囟附近耳尖水平中線矢狀縫一側(cè)用電鉆鉆開一直徑約5 mm的孔，去掉硬腦膜，暴露腦組織。所有暴露組織用液體石蠟覆蓋。膈神經(jīng)置于雙極銀絲電極，放電經(jīng)CyberAmp380生物放大器放大后引入NI-DAQ數(shù)據(jù)采集卡(NI公司，美國)，通過Labview軟件采樣(10 kHz)記錄，同時(shí)膈神經(jīng)放電輸入積分儀。

1.3.2 注射部位及方法 注射之前，先將鎢絲微電極植入背側(cè)腦橋(前囟后9.5～10 mm，中線旁開2.2～2.4 mm，背側(cè)表面深入7.7～8.7 mm)內(nèi)，給予電刺激，出現(xiàn)呼吸抑制效應(yīng)的區(qū)域確定為注藥位點(diǎn)。刺激參數(shù):20～50 μA，頻率80 Hz。使用PPM-2微量注射系統(tǒng)分別向背側(cè)腦橋壓力注射D-AP5(DAP5組，n=5)、BIC(BIC組，n=5)20～50 nL。向背側(cè)腦橋KF核以相同速度注射同等劑量、pH值和滲透壓的人工腦脊液作為對照組，以排除注射速度、濃度、pH值、滲透壓對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在背側(cè)腦橋以外的區(qū)域(電刺激不引起呼吸抑制效應(yīng))微量注射D-AP5、BIC作區(qū)域?qū)φ铡?/p>

1.3.3 低氧刺激方法 將人工通氣氣體從21%O2切換至8%O2(N2平衡)30～50 s。對照組給予低氧刺激前先記錄1 min的膈神經(jīng)放電作為基線，低氧刺激后再記錄5 min作為后對照。向背側(cè)腦橋分別微量注射D-AP5及BIC 20～50 nL，2 min后，給予8%O230～50 s，微量注射后90 min，待膈神經(jīng)放電恢復(fù)到前對照水平再次給予8%O230～50 s。

1.3.4 指標(biāo)觀察方法 采用自編Matlab軟件測量膈神經(jīng)放電幅度(AMP)、吸氣時(shí)間(Ti)、呼氣時(shí)間(Te)，以60/(Ti+Te)為某呼吸周期的瞬時(shí)呼吸頻率(f)。取急性低氧刺激前，對照組(1 min)內(nèi)的平均AMP、Ti、Te、f的基線值。以基線值為標(biāo)準(zhǔn)對各個(gè)呼吸周期的AMP、Ti、Te、f進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。以Te為例:標(biāo)準(zhǔn)化Te=［(Te-Te基線值)/Te基線值］+ 1。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分4個(gè)時(shí)期，分別是前對照(低氧刺激前對照記錄1 min期間平均呼吸參數(shù));急性低氧期(低氧開始后20～30 s期間平均呼吸參數(shù));PHFD期(低氧通氣結(jié)束恢復(fù)正常通氣后前10 s期間平均呼吸參數(shù))以及后對照(低氧通氣結(jié)束后6～7 min期間平均呼吸參數(shù))。統(tǒng)計(jì)各階段平均AMP、Ti、Te、f的測量值(絕對值)及標(biāo)準(zhǔn)化值。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用自編Matlab軟件。計(jì)量資料用s表示，組間比較采用Student's t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D-AP5對低氧呼吸反應(yīng)的作用結(jié)果 與對照組比較，D-AP5組急性低氧反應(yīng)期膈神經(jīng)f、Te、Ti及AMP變化無明改變(P均＞0.05);但PHFD期膈神經(jīng)放電Te延長幅度及f下降幅度明顯減小(P均＜0.05)，PHFD現(xiàn)象削弱。見表1。

表1 微量注射AP5前后兩組低氧反應(yīng)各指標(biāo)改變情況比較(n=5，s)

表1 微量注射AP5前后兩組低氧反應(yīng)各指標(biāo)改變情況比較(n=5，s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別 f(%)Te(%)Ti(%)AMP(%)急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期對照組 18.28±0.02 35.19±0.08 13.98±0.02 93.25±0.25 15.78±0.07 16.09±0.08 15.78±0.07 16.09±0.08 AP5組 16.33±0.04 17.89±0.07* 10.32±0.06 52.98±0.18* 20.46±0.07 27.31±0.10 20.46±0.07 27.31±0.10

2.2 BIC對低氧呼吸反應(yīng)的作用結(jié)果 與對照組比較，BIC組急性低氧反應(yīng)期膈神經(jīng)放電f升高的幅度、呼氣時(shí)間縮短的幅度均明顯增大(P均 ＜ 0.05)，PHFD期膈神經(jīng)放電無顯著性變化(P均＞0.05)。見表2。

表2 微量注射BIC前后兩組低氧反應(yīng)各指標(biāo)改變情況比較(n=5，s)

表2 微量注射BIC前后兩組低氧反應(yīng)各指標(biāo)改變情況比較(n=5，s)

注:與對照組比較，*P＜0.05。

組別 f(%)Te(%)Ti(%)AMP(%)急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期 急性低氧期 PHFD期對照組 25.49±0.02 36.65±0.07 24.43±0.02 89.57±0.21 5.66±0.02 21.8±0.05 8.14±0.04 17.14±0.06 BIC組 37.96±0.05* 29.41±0.09 31.29±0.04* 74.14±0.25 7.20±0.03*16.90±0.03 10.71±0.06 17.57±0.12

3 討論

外周化學(xué)感受器反射是中介低氧呼吸反應(yīng)的主要因素。存在于頸動(dòng)脈體和主動(dòng)脈體的外周化學(xué)感受器將刺激信息經(jīng)竇神經(jīng)和迷走神經(jīng)傳入［13～15］，止于延髓的孤束核［13］。我們實(shí)驗(yàn)室通過c-Fos蛋白免疫組織化學(xué)方法及CTB逆行標(biāo)記方法研究了孤束核到腦橋背側(cè)的功能通路。在腦橋背側(cè)注射CTB可以在孤束核觀察到逆行標(biāo)記神經(jīng)元。低氧刺激可以使部分逆行標(biāo)記神經(jīng)元表達(dá)c-Fos蛋白［13］。這表明低氧激活孤束核神經(jīng)元，即外周化學(xué)感受器二級或更高級中繼神經(jīng)元。它們的軸突或軸突分支投射到并終止于背側(cè)腦橋。我們還采用逆行興奮方法研究了孤束核低氧敏感神經(jīng)元向腦橋背側(cè)區(qū)域的軸突投射。我們在大鼠孤束核共記錄到30個(gè)神經(jīng)元單位放電可被電刺激背側(cè)腦橋逆行興奮，逆行興奮潛伏期在1.5～3.5 ms，平均2.4 ms。其中半數(shù)逆行興奮神經(jīng)元又可被低氧刺激興奮［16］。

另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，背側(cè)腦橋的PB核選擇性中介低氧呼吸反應(yīng)的頻率成份［10］。電損毀或化學(xué)損毀PB核后給予低氧刺激，低氧時(shí)呼吸頻率升高的幅度降低了70%～80%，這主要是由于呼氣時(shí)程縮短的幅度降低導(dǎo)致的。低氧時(shí)吸氣時(shí)程縮短、吸氣幅度增大及低氧后呼吸頻率下降的現(xiàn)象沒有明顯變化。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在背側(cè)腦橋，NMDA受體主要參與了PHFD現(xiàn)象的調(diào)控，GABA受體主要參與急性低氧時(shí)呼吸頻率的調(diào)控。腦橋呼吸調(diào)整中樞通過整合來自于外周化學(xué)感受器的傳入信息調(diào)節(jié)外周化學(xué)感受器所中介的低氧呼吸反應(yīng)的頻率成份。

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