瑞舒伐他汀對急性心肌梗死患者行擇期PCI術后外周血TLR4表達及炎性因子的影響

路妍 張建華

瑞舒伐他汀對急性心肌梗死患者行擇期PCI術后外周血TLR4表達及炎性因子的影響

路妍 張建華

目的 觀察急性心肌梗死患者行擇期經皮冠狀動脈介入治療(PCI)術后外周血單核細胞Toll樣受體4(TLR4)表達變化，同時觀察瑞舒伐他汀強化治療對TLR4及炎性因子的影響。方法 選取急性心肌梗死患者90例為病例組。同期進行健康體檢的正常人70例為對照。采用Real time-PCR和Western blot測定外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達。采用Gensini評分判定冠脈病變嚴重程度。病例組隨機分為治療A組和治療B組，每組45例，2組均接受常規治療，治療B組在常規治療基礎上于PCI術前7 d給予口服瑞舒伐他汀10 mg/d。觀察2組術前、術后7 d左心室射血分數(LVEF)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、TLR4 mRNA和蛋白表達及hs-CRP、TNF-α、IL-6水平變化。結果 (1)對照組比較，病例組外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。且隨著冠脈病變嚴重程度增加，外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達逐漸升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。相關性分析顯示，外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達與冠脈病變嚴重程度具有正相關性(P＜0.05)。(2)病例組治療后與術前比較，術后7 d治療A組和治療B組LVEF均顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，且治療B組顯著高于同期治療A組(P＜0.05)。術后7 d治療A組和治療B組LVESD、LVEDD、TLR4 mRNA和蛋白表達、hs-CRP、TNF-α、IL-6水平均顯著降低，差異有統計學意義(P ＜0.05)，且治療B組顯著低于同期治療A組(P＜0.05)，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論 急性心肌梗死患者行擇期PCI術前短期應用瑞舒伐他汀能夠顯著改善心功能，其機制與抑制TLR4炎癥信號通路激活有關。

瑞舒伐他汀;急性心肌梗死;擇期;冠狀動脈介入治療;Toll樣受體4

冠心病是嚴重影響中老年人群生命安全和生活質量的常見心血管疾病之一，病死率和致殘率高，預后差［1］。近年來，經皮冠狀動脈介入術(PCI)已經成為治療急性心肌梗死的首選治療手段。但是，PCI術后通過誘導局部炎性反應導致心肌損傷及主要不良心血管事件發生，是患者預后不良的獨立危險因素［2，3］。研究顯示，Toll樣受體4(TLR4)炎癥信號通路激活后通過促進核因子-κB(NF-κB)的激活和核轉位，上調hs-CRP、TNF-α、IL-6 等炎性因子的表達，在動脈粥樣硬化斑塊不穩定性中發揮重要作用［4］。然而，TLR4表達水平在急性心肌梗死發生發展和冠脈病變嚴重程度的關系及瑞舒伐他汀強化治療對其表達的影響目前報道尚少。本研究旨在觀察急性心肌梗死患者外周血單核細胞TLR4的表達變化及擇期PCI術前瑞舒伐他汀治療對TLR4表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年3月至2015年3月我院收治的急性心肌梗死患者90例為病例組，隨機分為治療A組和治療B組，每組45例。治療A組男25例，女20例;年齡35～70歲，平均年齡(58.85±8.67)歲;治療B組男28例，女17例;年齡33～72歲，平均年齡(59.21±8.90)歲。2組年齡、性別比、原發疾病、Killip分級、梗死部位等一般資料比較差異無統計學意義(P ＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=45

1.2 納入及排除標準 納入標準:(1)心肌缺血引起的胸痛癥狀持續時間超過30 min;(2)心電圖具有典型的動態變化，即至少2個以上相鄰導聯ST段抬高;(3)血清心肌壞死標志物肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(cTnI)等水平升高超過正常者2倍以上;(4)發病持續時間超過1 d，不符合急診PCI指征;(5)所有患者均簽署知情同意書。排除標準:(1)合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者;(2)凝血功能障礙患者;(3)自身免疫性疾病、腦卒中、惡性腫瘤患者;(4)有他汀類藥物過敏史者。

1.3 治療方法 治療A組和治療B組均給予腸溶阿司匹林抗凝、β受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、氯吡格雷等常規治療。治療B組在常規治療基礎上術前7 d口服瑞舒伐他汀(舒夫坦，南京先聲東元制藥有限公司)10 mg/d，1次/d，睡前服用。

1.4 檢測方法

1.4.1 Real time-PCR:根據GeneBank中人TLR4 mRNA序列，采用Primer軟件設計引物，由上海生物工程有限公司合成。Trizol提取外周血單個核細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度。以總RNA為模板，按照反轉錄試劑盒說明書進行操作，合成cDNA第1鏈。PCR反應在ABI 7300型實時熒光定量PCR儀上進行，擴增完畢后進入儀器自帶的SDS v1.3軟件結果分析界面，使用SPSS 10.0統計計算樣品間Ct值。設對照組樣品為標準1，目的基因mRNA相對表達水平為2-△△Ct，設β-actin為內參照基因。見表2。

表2 Real time-PCR引物序列及擴增產物長度

1.4.2 Western blot:外周血單個核細胞加入RIPA裂解液200 μl，冰上放置30 min充分裂解細胞。提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，每組取100 μg總蛋白進行10%SDS-PAGE電泳，將目的蛋白電轉移至PVDF膜，10%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h。加入特異性一抗孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，ECL化學發光法顯色、定影。

1.4.3 ELISA法:分別于PCI術治療前后抽取患者清晨空腹靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存備用。采用 ELISA法測定血清 hs-CRP、TNF-α、IL-6水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴格按照試劑盒說明書操作。960酶標儀購自美國Sigma公司。

1.4.4 心功能檢測:采用高分辨率彩色多普勒超聲診斷儀(美國PHILIPS公司)觀察心功能相關指標，包括左心室射血分數(LVEF)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)。

1.5 統計學分析 應用SPSS 10.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組和病例組外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達比較 與對照組比較，病例組外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表3。

2.2 不同病變支數病例組患者外周血單核細胞TLR4mRNA和蛋白表達比較 與對照組比較，隨著病變支數的增加，病例組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達逐漸升高，兩兩相比差異有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表3 對照組和急性心肌梗死患者組外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達比較±s

表3 對照組和急性心肌梗死患者組外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達比較±s

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別 TLR4 mRNA相對表達水平TLR4蛋白相對表達水平對照組(n=70)0.78±0.12 0.57±0.09病例組(n=90) 4.99±0.74* 4.68±0.65*

表4 不同病變支數病例組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達比較±s

表4 不同病變支數病例組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達比較±s

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與1支病變比較，#P ＜0.05;與2支病變比較，△P ＜0.05

組別 TLR4 mRNA相對表達水平TLR4蛋白相對表達水平對照組(n=70)0.78±0.12 0.57±0.09病例組1支病變(n=36) 3.46±0.53* 3.28±0.49*2支病變(n=33) 4.77±0.71*# 4.46±0.63*#3支病變(n=21) 5.64±0.82＊△ 5.38±0.77＊△

2.3 病例組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達與冠脈病變嚴重程度的關系 Sperman相關分析結果顯示，病例組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達與冠脈病變支數呈正相關性，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

2.4 病例組治療前后心功能比較 術前治療A組和治療B組LVEF、LVESD、LVEDD比較差異無統計學意義(P＞0.05)。術后7 d 2組LVEF均較術前顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，且治療B組顯著高于同期治療A組(P＜0.05);術后7 d 2組LVESD、LVEDD均較術前顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，且治療B組顯著低于同期治療A組(P＜0.05)。見表5。

表5 病例組治療前后心功能比較n=45，±s

表5 病例組治療前后心功能比較n=45，±s

注:與術前比較，*P＜0.05;與治療A組比較，#P ＜0.05

組別 LVEF(%) LVESD(mm) LVEDD(mm)治療A組術前 31.78±4.53 52.89±6.33 69.31±7.65術后7 d 36.89±5.05* 49.92±5.35* 63.29±6.40*治療B組術前 32.12±4.67 53.02±6.42 69.12±7.58術后7 d 40.11±6.23*# 45.06±4.23*# 57.21±6.23*#

2.5 病例組治療前后TLR4 mRNA和蛋白表達比較

術前治療A組和治療B組TLR4 mRNA和蛋白表達比較差異無統計學意義(P＞0.05);術后7 d 2組TLR4 mRNA和蛋白表達均較術前顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，且治療B組顯著低于同期治療A組(P ＜0.05)。見表6。

表6 病例組治療后TLR4 mRNA和蛋白表達比較n=45，±s

表6 病例組治療后TLR4 mRNA和蛋白表達比較n=45，±s

注:與術前比較，*P ＜0.05;與治療A組比較，#P ＜0.05

組別 TLR4 mRNA相對表達水平 TLR4蛋白相對表達水平治療A組術前 4.95±0.70 4.62±0.62術后7 d 3.52±0.49* 3.31±0.36*治療B組術前 5.04±0.78 4.72±0.69術后7 d 2.68±0.42*# 2.47±0.33*#

2.6 病例組治療前后炎性因子比較 術前治療A組和治療B組hs-CRP、TNF-α、IL-6比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。術后7 d 2 組 hs-CRP、TNF-α、IL-6 均較術前顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，且治療B組顯著低于同期治療A組(P＜0.05)。見表7。

表7 病例組治療前后炎性因子比較n=45，±s

表7 病例組治療前后炎性因子比較n=45，±s

注:與術前比較，*P ＜0.05;與治療A組比較，#P ＜0.05

組別 hs-CRP(mg/L) TNF-α(ng/L) IL-6(pg/L)治療A組術前 34.15±5.23 278.56±17.29 43.65±5.34術后7 d 21.33±3.24* 157.43±11.43* 26.77±4.12*治療B組術前 32.87±5.02 282.34±19.32 41.38±5.12術后7 d 10.42±1.46*# 54.16±7.45*# 13.34±2.02*#

3 討論

研究顯示，TLR4炎癥信號通路的激活在冠狀動脈粥樣硬化發生發展中發揮關鍵作用［5］。TLR4信號通路通過MyD88依賴性和MyD88非依賴性途徑促進NF-κB 的活化和核轉位，從而上調 hs-CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子的表達和釋放，導致斑塊不穩定性增加及冠心病的發生發展［4］。hs-CRP是機體炎性反應的敏感性標志物，能夠促進TNF-α、IL-6表達，與炎癥程度、不良心血管事件發生及預后呈正相關［6］。TNF-α是主要有活化巨噬細胞分泌的促炎因子，能夠抑制心肌收縮力、激活并誘導中性粒細胞在組織的積聚，從而加重局部炎性反應［7］。IL-6是單核細胞、巨噬細胞分泌的關鍵促炎因子，具有促進斑塊形成的作用并導致斑塊不穩定性增加。基礎和臨床研究證實，急性心肌梗死患者尤其是合并不良心血管事件的患者外周血和不穩定斑塊中TLR4、TNF-α、IL-6等促炎因子水平顯著升高，預示患者預后不良［8，9］。本研究結果顯示，病例組患者外周血單核細胞TLR4 mRNA和蛋白表達較健康對照組顯著升高，且其表達與冠脈病變嚴重程度具有正相關性(P ＜0.05)，與前人報道［10］一致，說明急性心肌梗死患者外周血單核細胞TLR4表達與主要心血管不良事件發生及患者預后密切相關。

臨床研究證實，術前強化瑞舒伐他汀治療對PCI術后心肌損傷具有明顯保護作用，能夠明顯降低心血管事件發生率，但其具體機制尚不清楚［11］。本研究結果顯示，病例組經治療后，治療B組PCI術后LVEF顯著高于治療 A組，LVESD、LVEDD、TLR4 mRNA和蛋白表達、hs-CRP、TNF-α、IL-6顯著低于治療 A 組，差異有統計學意義(P＜0.05)，說明PCI術前強化瑞舒伐他汀治療可能通過下調TLR4表達抑制炎性反應，穩定粥樣斑塊并減少不良心血管事件發生。

綜上所述，急性心肌梗死患者外周血單核細胞TLR4表達顯著升高，且與冠脈病變嚴重程度密切相關。PCI術前強化瑞舒伐他汀治療能夠明顯改善患者心功能，其機制與下調外周血單核細胞TLR4表達，進而抑制炎性反應有關。

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Effects of rosuvastatin on Toll-like receptor 4 expression in peripheral blood monouclear cell and on inflammatory factor in patients with acute myocardial infarction after selective percutaneous coronary intervention

LU Yan，ZHANG Jianhua．Department of Internal Medicine，Gneral Hospital of Jizhong Energy Sources Fengfeng Group，Hebei，Handan 056002，China

Objective To observe the change of Toll-like receptor 4(TLR4)in acute myocardial infarction(AMI)patients undergoing selective percutaneous coronary intervention(PCI)and to investigate the effects of rosuvastatin on Toll-like receptor 4 expression in peripheral blood monouclear cell and on inflammatory factor.Methods A total of 90 patients with AMI treated by PCI were enrolled in the study.Meanwhile 70 healthy subjects were served as control group.Real time-PCR and Western Blot were used to detect the expression levels of TLR4 mRNA and protein.Gensini score was used to evaluate the severity of coronary artery lesions.The 90 patients were randomly divided into two groups:group A and group B，with 45 patients in each group.The patients in both groups

routine therapy，however，the patients in group B，on the basis of routine therapy，were given orally rosuvastatin(10mg/d)on 7 days before PCI.The changes of LVEF，LVESD，LVEDD，TLR4 mRNA and protein，hs-CRP，TNF-α，IL-6 were detected before surgery and on 7d after surgery.Results As compared with those in control group，the expression levels of TLR4 mRNA and protein were significantly increased in patients with AMI(P ＜0.05).Moreover the expression levels of TLR4 mRNA and protein were gradually increased，with the increasing of severity of coronary lesions(P＜0.05).The correlation analysis showed that the expression levels of TLR4 mRNA and protein were positively correlated to the severity of coronary lesions(P＜0.05).As compared with that before therapy，LVEF in both treatemt groups were significantly increased on 7d after PCI(P ＜0.05)，furthermore，LVEF in group B was significantly higher than that in group A(P ＜0.05).The levels of LVESD，LVEDD，TLR4 mRNA and protein，hs-CRP，TNF-α，IL-6 in both treatment groups were significantly decereased on 7d after PCI，as compared with those before surgery(P ＜0.05)，moreover，which in group B were significantly lower than those in group A(P ＜0.05).Conclusion The short-term application of rosuvastatin before elective PCI surgery in patients with AMI can obviously improve patient’s cardiac function，and its action mechanism may be related with inhibiting the activation of TLR4 signal transduction pathway.

rosuvastatin;acute myocardial infarction;selective period;percutaneous coronary intervention therapy;Toll-like receptor 4

R 542.22

A

1002-7386(2015)23-3544-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．007

056002 河北省邯鄲市，冀中能源峰峰集團總醫院邯鄲院區內科

2015-07-20)