一株含油污泥多環(huán)芳烴降解菌的分離鑒定和降解特性

牛志剛 王新新 吳亮,3 楊靜

（1中海油能源發(fā)展采油服務(wù)公司 天津 300452 2中海石油環(huán)保服務(wù)有限公司 天津 300452 3中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266100)

含油污泥是石油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的一種重要的工業(yè)污染物，主要是由高濃度的石油烴和泥砂等成分組成的一種極為復(fù)雜的危險(xiǎn)固體廢棄物。特別是其中含有的高濃度多環(huán)芳烴等有機(jī)烴類污染物具有強(qiáng)烈的致癌致畸致突變的“三致”效應(yīng)，對(duì)生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定和人體健康構(gòu)成了巨大威脅[1]。目前多環(huán)芳烴已被世界上多個(gè)國(guó)家和地區(qū)列為優(yōu)先控制污染物，因此急需快速有效的處理技術(shù)根治這類污染物。目前，超聲凍融法、表面活性劑洗脫和熱化學(xué)法等物理化學(xué)技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用于含油污泥的處理[2,3]。盡管物理化學(xué)處理技術(shù)具有速度快、效果好的優(yōu)點(diǎn)，但是處理費(fèi)用過(guò)于昂貴并且容易造成生態(tài)環(huán)境的二次污染。生物處理方法利用生物的代謝活動(dòng)將污染物逐漸降解，具有費(fèi)用低廉和環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)，因而受到各國(guó)科研人員的重視[4,5]。采用多環(huán)芳烴降解菌降解含油污泥中的多環(huán)芳烴是治理這一優(yōu)先控制污染物的有效方法[6]，因此有必要對(duì)其中含有的多環(huán)芳烴降解菌進(jìn)行深入分析。然而，目前關(guān)于含油污泥中多環(huán)芳烴降解菌的分離并不多見。目前僅有Bacillus和Pseudomonas等多環(huán)芳烴降解菌生存在含油污泥中的報(bào)道[7]。因此，急需獲得更多的含油污泥多環(huán)芳烴降解菌菌株，以豐富降解菌資源。

本研究采用富集培養(yǎng)方法從典型含油污泥樣品中分離多環(huán)芳烴降解菌，綜合采用16SrRNA基因序列和生理生化方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步分析其生長(zhǎng)特性和降解特性，以期獲得含油污泥中多環(huán)芳烴降解菌多樣性的基本信息，為含油污泥的生物處理提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采集某油田的典型含油污泥。采用常規(guī)分析方法分析該含油污泥樣品的全氮、有機(jī)質(zhì)、含水量、pH值和石油烴等基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試含油污泥的基本理化性質(zhì)

1.2 多環(huán)芳烴降解菌的富集和分離

取10g含油污泥放入90mL以多環(huán)芳烴萘、蒽、菲和芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。于30℃搖床120r·min-1恒溫富集培養(yǎng)10d。吸取10mL富集培養(yǎng)液，接種到90mL新鮮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中。不斷重復(fù)上述操作，富集培養(yǎng)3次。從含有以多環(huán)芳烴萘、蒽、菲和芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上采用稀釋平板涂布法分離純化單菌落[8]。

1.3 多環(huán)芳烴降解菌的鑒定

將分離獲得的純菌株接種到TSB培養(yǎng)基上，觀察記錄菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色。采用Omega細(xì)菌DNA提取試劑盒和Omega瓊脂糖凝膠回收試劑盒提取純化菌株基因組DNA。采用細(xì)菌16SrRNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)一步純化[9]。采用ABI3730XLDNAanalyzer進(jìn)行測(cè)序。將得到的序列用BLAST程序與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，手動(dòng)下載相似性較高的16SrRNA序列，并采用ClustalW程序進(jìn)行多序列對(duì)齊。采用MEGA4.0軟件的Neighbor-Joining方法和Jukes-Cantor模型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，重復(fù)取樣1000次進(jìn)行自展值分析[10]。該菌株16SrRNA序列的登錄號(hào)為：KM525670。采用常規(guī)方法進(jìn)一步進(jìn)行生理生化鑒定分析。

1.4 多環(huán)芳烴降解菌的生長(zhǎng)特性和降解特性

分別以10%的接種量將菌液接種到以石油烴、正十六烷、多環(huán)芳烴萘、菲、蒽和芘為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃搖床120r·min-1恒溫培養(yǎng)15d。以不添加碳源的接菌培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè)定各培養(yǎng)液的OD600，以考察菌株對(duì)烴類底物的利用能力。采用氣相色譜法測(cè)定殘留多環(huán)芳烴的含量，考察菌株對(duì)多環(huán)芳烴的降解能力[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多環(huán)芳烴降解菌的分離

通過(guò)富集馴化和分離純化等步驟，經(jīng)過(guò)初篩復(fù)篩，得到一株多環(huán)芳烴降解菌W13020。該菌株在TSB培養(yǎng)基上的菌落呈淺黃色，表面濕潤(rùn)，略透明，邊緣整齊、菌落圓形，扁平。顯微觀察革蘭氏染色陰性，細(xì)胞呈桿狀。采用16SrRNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。菌株W13020與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia MTCC 434T的同源性高達(dá)99.0%，高于其他模式菌株。采用常規(guī)方法進(jìn)一步進(jìn)行生理生化鑒定分析，結(jié)果如表2所示。該菌株可耐受4%NaCl，生長(zhǎng)pH值5~9，可以利用土溫80、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖和果糖。產(chǎn)生蛋白酶和DNA酶，而不產(chǎn)生氧化酶和脲酶。具有明膠液化和硝酸鹽還原能力，H2S和甲基紅實(shí)驗(yàn)陰性。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果和生理生化分析結(jié)果，該菌株可被鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia。

圖1 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 的生理生化特征

1960年Hugh R等[11]發(fā)現(xiàn)并命名了嗜麥芽假單胞菌（Pseudomonasmaltophili）。1983年Swings J等[12]通過(guò)表型數(shù)據(jù)分析又將其命名為嗜麥芽黃單胞菌（Xanthomonasmaltophili）。1993年P(guān)alleroni NJ等[13]再一次將其命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）。Carmody LA等[14]通過(guò)對(duì)766株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌進(jìn)行詳細(xì)的生理生化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種菌的生理生化特征具有明顯的多樣性，這也印證了對(duì)該菌的鑒定具有一定困難。我們通過(guò)16S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，菌株W13020與StenotrophomonasmaltophiliaMTCC 434T的同源性高達(dá)99.0%，并且生理生化分析結(jié)果與模式菌株基本一致。因此，將菌株W13020鑒定為嗜麥芽黃單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia是可靠的。

采用氣相色譜法分析多環(huán)芳烴降解菌W13020對(duì)4種多環(huán)芳烴的降解率，結(jié)果如圖2所示。W13020菌株對(duì)萘、蒽、菲和芘的15d降解率分別為72.1±3.7%、45.1±15.6%、42.2±5.2%和31.2±9.0%，說(shuō)明W13020菌株對(duì)多環(huán)芳烴具有明顯的降解能力。其中，該菌對(duì)萘的降解率顯著（P<0.05）高于其它3種多環(huán)芳烴，說(shuō)明該菌對(duì)低分子量多環(huán)芳烴的降解能力較強(qiáng)。此外，該菌株不能利用正十六烷，但是可以利用石油烴為唯一碳源和能源生長(zhǎng)。這可能是由于該菌利用石油烴里的多環(huán)芳烴組分造成的。Stenotrophomonas maltophilia的多環(huán)芳烴降解能力多有報(bào)道。Gao S等[15]從雜酚油污染土壤中分離得到了一株Stenotropho monasmaltophilia C6，并深入研究了該菌株降解菲的降解途徑，識(shí)別了22個(gè)中間代謝產(chǎn)物。Chen S等[16]發(fā)現(xiàn)Stenotropho monasmaltophilia在銅離子存在的情況下仍然可以降解苯并芘。Urszula G等[17]從活性污泥中分離得到了一株Stenotropho monasmaltophilia KB2，可以降解苯酚和兒茶酚等單環(huán)芳烴，并具有兒茶酚1,2-雙加氧酶活性。然而，具有多環(huán)芳烴降解能力的Stenotropho monasmaltophilia并未發(fā)現(xiàn)存在于含油污泥中。本研究通過(guò)富集培養(yǎng)從含油污泥中分離得到了一株可以降解萘、蒽、菲和芘的Stenotrophomonas maltophilia W13020，證實(shí)了Stenotropho monasmaltophilia也生存于含油污泥的環(huán)境中。

圖2 多環(huán)芳烴降解菌W 13020 對(duì)4 種多環(huán)芳烴的降解率

3 結(jié)語(yǔ)

本研究從含油污泥中分離得到一株多環(huán)芳烴降解菌W13020。采用16S rRNA基因序列和生理生化方法將其鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia。該菌株可以利用石油烴、多環(huán)芳烴萘、菲、蒽和芘為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，對(duì)萘、蒽、菲和芘等多環(huán)芳烴具有明顯的降解能力。

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