維氏氣單胞菌生物膜體外模型的建立及影響因素的研究

夏京津，張海月，許瑞，張冬星，龍繼兵，徐洋， 沈錦玉，康元環，單曉楓*，錢愛東*

(1.吉林農業大學動物科學技術學院,長春 130118；2.農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省淡水水產研究所，浙江湖州，313001)

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維氏氣單胞菌生物膜體外模型的建立及影響因素的研究

夏京津1#，張海月1#，許瑞1，張冬星1，龍繼兵1，徐洋2， 沈錦玉2，康元環1，單曉楓1*，錢愛東1*

(1.吉林農業大學動物科學技術學院,長春 130118；2.農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江省淡水水產研究所，浙江湖州，313001)

為探索不同理化因素對致病性維氏氣單胞菌(Aeramonasveronii，AV)TH0426成膜的影響，采用改良微孔板法建立致病性AV生物膜體外模型并對其進行了研究。結果表明，AVTH0426能夠在聚乙烯酶標板表面形成生物膜，PH值4～6，10 ℃和NaCl濃度4 g/L培養18 h是形成生物膜的最適條件，黃顙魚(Pseudobagrusfulvidraco)的肝臟提取液對AV TH0426形成生物膜有促進作用。這為進一步探討維氏氣單胞菌生物膜形成機制和致病機理提供了參考。

維氏氣單胞菌；形成特性；生物膜；影響因素

細菌生物膜(Biofilm，BF) 是指無柄微生物群落在各種載體表面上附著了一層由其自分泌的胞外多糖類基質[1]，是細菌相對于浮游狀態的一種群體生活方式。與游離的菌相比其形成生物膜的微生物具有很多不同的特征，標志性的特征就是對于抗菌劑的抗性增強，它可作為一種生物屏障，使存在于其中的菌體(被膜菌) 相對于其單個浮游狀態的菌體(浮游菌) 對抗菌藥物表現出更強的抗性。胞外基質還能有效的抑制免疫細胞的吞噬作用[2]，并且生物膜還能通過釋放游離的細菌導致再次感染，病原菌持續存在，導致慢性持續性感染或感染反復發作，是目前臨床上一大難題，為臨床抗感染治療帶來極大挑戰。

維氏氣單胞菌(Aeramonasveronii, AV)廣泛分布于水體環境中，是一種新型人-獸-魚共患病菌[3]。該菌不但可引起鯉、鯽、鰻及鱘魚等多種魚類發病,表現為出血和腹水；也可引起人的腹瀉、腦膜炎及敗血癥等。研究表明，維氏氣單胞菌對人和多種水產動物具有較強感染性和致病力。近年來，有關維氏氣單胞菌方面的報道逐漸增多，但其有關生物膜的研究還尚未見報道。本研究以源自黃顙魚(Pseudobagrusfulvidraco)的一株致病性AV TH0426為實驗材料，初步建立生物膜體外模型，并對生物膜形成的不同影響因素進行研究，為探討維氏氣單胞菌的生物膜形成機制和致病機理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養條件 黃顙魚源AV TH0426 菌株由浙江省淡水水產研究所徐洋助理研究員惠贈。接種于TSB中，培養至對數生長期，離心收集菌體，無菌生理鹽水調OD600值至 0.3 左右備用。

1.2 試劑TSB 培養基、RS鑒別培養基，購自北京陸橋技術責任公司；1% 結晶紫溶液(自制)、0.85%生理鹽水(自制)、PBS(自制)；BCA(BCA Protein Assay Kit)試劑盒，購自凱基生物科技有限公司。

1.3 生物膜的形成與測定 體外生物膜形成和測定方法參考毛秀秀等[4]的微孔板法并進行適當改進，具體步驟如下：將細菌懸液與TSB按 1:3 體積混合均勻后取 200 μL加入到 96 孔酶標板中，30 ℃培養 20 h 后棄去培養液，用生理鹽水清洗 3 次以去除游離細菌, 60 ℃干燥40 min后并加入 200 μL 1% 結晶紫溶液染色 10 min，生理鹽水清洗 3 次，加入 33%乙酸 200 μL溶解與生物膜結合的結晶紫，0.5 h后用酶標儀測定 OD590值。各實驗均設 11 個平行, 以不含菌液的培養液為空白對照。測定值減去空白對照值大于0.12判定生物膜為陽性[5]。

1.4 不同培養時間對AVTH0426生物膜形成的影響 將培養時間設置為 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60 h, 按 1.2項方法測定生物膜形成。

1.5 不同初始菌液濃度對AV TH0426生物膜形成的影響 將AV TH0426的起始濃度調至 2.0×109、 2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105、2.0×104、2.0×103、2.0×102CFU/mL的菌液, 按 1.2項方法測定生物膜形成。

1.6 不同培養溫度、pH 值對AV TH0426生物膜形成的影響 將培養溫度設置為4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40 ℃；配制 pH 值分別為 3、4、5、6、7、8、9、10，按 1.2項方法測定不同溫度和不同pH值對AV TH0426形成生物膜的影響。

1.7 不同NaCl濃度對AV TH0426生物膜形成的影響 分別配制含不同濃度NaCL的TSB培養液，NaCl濃度分別為0、2、4、10、20、30、50 g/L,以去離子水制備菌液進行無離子狀態實驗，按 1.2項方法測定不同NaCl濃度對生物膜形成的影響。

1.8 不同組織提取液包被對AV TH0426生物膜形成的影響

1.8.1 黃顙魚不同組織提取液的制備 參考Chen等[6]方法分別收集一定量的黃顙魚肌肉、肝臟、脾臟、小腸、腎臟提取其蛋白，采用BCA試劑盒將蛋白質含量調至1 mg/mL,然后采用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌2次，再放置4 ℃冰箱備用。

1.8.2 黃顙魚不同組織提取液包被對AV TH0426生物膜形成的影響 在96孔酶標板各孔分別加入200 μL制備的黃顙魚肌肉、肝臟、脾臟、小腸、腎臟的組織提取液，4 ℃包被18 h后棄去殘留的組織液，用250 μL生理鹽水清洗2次，按 1.2項方法測定不同組織提取液包被后所形成的生物膜的 OD590值。以未經組織液包被的酶標板為陰性對照。

1.9 數據處理 結果以平均值±標準差表示，用SPSS 16.0進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 培養時間對AV TH0426生物膜形成的影響 圖1為不同培養時間對AVTH0426形成生物膜的影響，從圖中可以看出其生物膜形成量出現二個峰值，尤以培養18 h形成量最高，之后隨培養時間的延長而逐漸降低。

圖1 不同培養時間AV TH0426形成的生物膜的 OD590值 (柱上完全不同的字母表示組間數據差異顯著P<0.05，其他字母表示組間數據差異不顯著P>0.05)

2.2 初始菌液濃度對AV TH0426生物膜形成的影響 從圖2可以看出，隨著初始菌液濃度的降低，AV TH0426生物膜的形成量呈逐漸降低的趨勢，初始菌液濃度在2×109CFU/mL和2×108CFU/mL時，細菌生物膜形成量最大，兩者在統計學意義上無顯著差異；但OD590的數值直觀顯示，初始菌液濃度在2×109CFU/mL時，細菌生物膜形成量更大。

圖2 不同初始菌液濃度AV TH0426形成的生物膜的OD590值(柱上完全不同的字母表示組間數據差異顯著P<0.05，其他字母表示組間數據差異不顯著P>0.05)

2.3 培養溫度對AV TH0426生物膜形成的影響從圖3可以看出在10 ℃是生物膜生成量最高(P<0.05)，在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃時生物膜形成量逐漸降低，在4 ℃時AV TH0426能形成生物膜，在40 ℃時不能形成生物膜。

圖3 不同溫度AV TH0426形成的生物膜的OD590值(柱上完全不同的字母表示組間數據差異顯著P<0.05，其他字母表示組間數據差異不顯著P>0.05)

2.4 不同 pH 值對AV TH0426生物膜形成的影響 在起始pH值為3時AV TH0426生物膜形成量較低。在起始pH值為4～10范圍內均能形成較多生物膜，其酸性條件下比中性和堿性更容易形成生物膜(P<0.05)。

圖4 AV TH0426在不同 pH 值條件下形成的生物膜的OD590值(柱上完全不同的字母表示組間數據差異顯著P<0.05，其他字母表示組間數據差異不顯著P>0.05)

2.5 不同NaCl濃度對AV TH0426生物膜形成的影響 從圖5可以看出NaCl濃度在0 g/L時AV TH0426能形成生物膜，添加NaCl生物膜形成量明顯增加，在4 g/L時生物膜形成量最大，30、50 g/L時AV TH0426幾乎不能形成生物膜。2.6 黃顙魚不同組織提取液包被對AV TH0426生物膜形成的影響 AV TH0426在黃顙魚的肝臟提取液包被的96孔酶標板上生物膜形成量增加(P<0.05)，而在小腸、脾臟、肌肉、腎臟組織提取液包被的酶標板上的生物膜形成量與對照組差異不顯著(P>0.05)。

圖5 AV TH0426在添加不同NaCl濃度條件下形成的生物膜的OD590值(柱上完全不同的字母表示組間數據差異顯著P<0.05，其他字母表示組間數據差異不顯著P>0.05)

圖6 AV TH0426在包被不同組織提取液的酶標板上形成的生物膜的OD590值(柱上完全不同的字母表示組間數據差異顯著P<0.05，其他字母表示組間數據差異不顯著P>0.05)

3 討論與小結

已有研究發現, 細菌生物膜的形成是一個動態過程, 包括可逆性黏附、不可逆性黏附、微菌落形成、生物膜成熟和解聚等階段，在各階段具有不同的生理生化特性[7-10]。本研究結果顯示，AV TH0426的生物膜形成基本上也可以分為 4 個階段， 0～10 h 為早期黏附階段, 主要培養液中的游離菌黏附于酶標板表面并開始繁殖，導致酶標板表面的維氏氣單胞菌生物量逐步增加；10～14 h 為中間形成階段，然而該階段生物膜形成量呈短暫的降低趨勢, 可能是細菌二次生長的緣故，維氏氣單胞菌先利用易吸收的營養，再適應另一種易于形成生物膜的營養因子；14～18 h為生物膜成熟階段，維氏氣單胞菌生物膜形成量逐步增長；22 h之后為消退階段, 表現為該菌生物膜的量逐漸減少。

在研究初始濃度對維氏氣單胞菌生物被膜形成影響的結果發現，菌液的起始濃度達到2×108CFU/mL以上時更容易形成大量的生物膜，這與齊顯龍等[11]的結果一致；而陳強等[12]的研究也表明細菌的黏附量與菌濃度成正比，因此，黏附被認為是細菌在基質上成膜的第一步, 表明細菌起始濃度高有利于在基質上的黏附, 進而有利于生物膜的形成。綜上，AV TH0426生物膜的形成可能主要是來自培養液中細菌的集聚。

AV TH0426的最適生長溫度為25～35 ℃[3]，與其成膜最適溫度不一致。這說明生物膜的形成與其正常生長繁殖和生理活動上有所不同；與此結果相類似的是，AV TH0426適合生長的pH值為中性，其生物膜形成能力在酸性環境下較強。形成這些結果的具體原因，仍需進一步研究探討。

當NaCl濃度較低時，AV TH0426生物膜的形成量隨著NaCl濃度的增加而增加，這表明氯化鈉可促進生物膜的生成，與其他細菌的結果類似[13]。當NaCl濃度過高時, 細菌形成生物膜受到抑制, 原因可能是滲透壓過高,細菌受到來自環境的生存壓力較大, 生長受到影響, 進而影響生物膜的形成。

Sutherland[14]研究發現糖和蛋白質在生物膜的形成過程中發揮著重要的作用。本試驗發現，AV TH0426在黃顙魚的肝臟組織提取液包被的96孔酶標板上生物膜形成量增加，而在小腸、脾臟、肌肉和腎臟組織提取液包被的酶標板上的生物膜形成量與對照組差異不顯著，其原因也有待進一步研究。

本試驗結果表明，AV TH0426生物膜的形成受多種因素的影響，如菌液初始濃度、溫度、pH值、NaCl濃度以及黃顙魚不同組織提取液等對AV TH0426生物膜的形成均具有一定的影響；其中PH值4～6，10 ℃和NaCl濃度4 g/L培養18 h是形成生物膜的最適條件，黃顙魚的肝臟提取液對AV TH0426形成生物膜有促進作用。本研究結果將為進一步探討維氏氣單胞菌生物膜形成機制和致病機理提供依據。

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(編輯：侯向輝)

Establishment of invitroBiofilm Model and Influence Factors ofAeramonasveronii

XIA Jing-jin1#，ZHANG Hai-yue1#，XU Rui1，ZHANG Dong-xing1，LONG Ji-bing1，XU Yang2， SHEN Jin-yu2，KANG Yuan-huan1，SHAN Xiao-feng1*，QIAN Ai-dong1*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；2.KeyLaboratoryofHealthandAquacultureofFreshwaterFisheries，MinistryofAgriculture，ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries，Huzhou，Zhejiang313001,China)

To study the effect of different factors on bacterial biofilm formation invitro, the modified microtiter-plate test was used to establish an invitrobiofilm model of pathogenicAeramonasveroniiTH0426 strain. The results showed that AV TH0426 could develop biofilm on the surface of the polystyrene microtiter plate, and the optimum conditions for biofilm formation of AVTH0426 strain were pH 4～6, temperature 10 ℃, NaCl(4 g/L), and culturing for 18 h. The extract of liver increased the ability of biofilm formation by testing on the AV TH0426.

Aeramonasveronii(AV); characteristics; biofilm; physical factor

國家自然科學基金項目(31201927)；吉林省重點科技攻關項目(20150204065NY);國家大學生創新創業訓練計劃(201410193023)

夏京津，從事水產微生物學研究；張海月，碩士研究生，從事動物分子細菌研究，與夏京津為并列第一作者。

單曉楓,E-mail:sxf1997@163.com;錢愛東,E-mail:qianaidong0115@163.com

2015-07-16

A

1002-1280 (2015) 10-0010-05

S852.61