燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒的制備及質量評價

祖洪碧，李小華（重慶市長壽區人民醫院藥學部，重慶 401220）

燈盞乙素（Scutellarin）即5，6，4′-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷，是燈盞花素（Breviscapus）的主要有效成分，為菊科植物燈盞細辛（Erigeron breviscapus）的提取物。研究顯示，燈盞乙素在降低血液黏度、降低外周阻力、擴張血管、增加動脈流量、減少血小板計數和抑制血小板凝集等方面都有很好的臨床療效[1-2]。目前，臨床上其主要用于治療腦供血不足、腦出血所致后遺癥、腦血栓、冠心病、心絞痛等疾病[3]。但是，由于燈盞乙素水溶性很低、口服生物利用度差、半衰期短[4]，使其臨床使用受到了限制。聚乙二醇-聚乳酸/羥基乙酸共聚物（PEG-PLGA）為兩親性嵌段聚合物，具有較好的生物降解特征和生物相容性，幾乎無細胞毒性，有利于提高藥物的穩定性和透膜能力，達到緩釋和長效的結果。基于此，本研究制備了燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒，以期改善燈盞乙素的體內特征，增加其藥效。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Tecnai G2型透射電子顯微鏡（廈門億辰科技有限公司）；Zetasizer Nano ZS型納米粒度及Zeta電位分析儀（英國Malvern儀器公司）；RE-5250型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；GL-21M型高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；MS300型恒溫磁力攪拌器（上海般特儀器有限公司）；BS 210s型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

燈盞乙素對照品（批號：120914，純度：99.58%）、燈盞乙素原料藥（批號：120915，純度：99.20%）均購自昆明龍津藥業有限公司；PEG-PLGA（上海麗昂化學有限公司）；泊洛沙姆188（P188，湖北武漢健源化工有限公司）；聚山梨酯80和聚山梨酯20（天津市博迪化工有限公司）；丙酮（東莞市喬科化學有限公司）；乙酸乙酯、二氯甲烷購自深圳市科天化玻儀器有限公司，甲醇、乙腈為色譜純，水為室驗室自制的超純水。

2 方法與結果

2.1 燈盞乙素的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：WelchromTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V），流速：1 ml/min；檢測波長：335 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。該色譜條件下，燈盞乙素的出峰時間為9.7 min，其他輔料不干擾燈盞乙素的測定。

2.1.2 標準曲線制備 精密稱取燈盞乙素對照品15.06 mg，用甲醇溶解并稀釋成質量濃度分別為7.53、15.06、30.12、60.24、90.36、120.48 μg/ml的系列對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標、質量濃度（c）為橫坐標，進行回歸分析，得回歸方程為y＝19 764.52c+583.74（r＝0.999 7）。結果表明，燈盞乙素檢測質量濃度的線性范圍為7.53～120.48 μg/ml。

2.1.3 回收率試驗 取質量濃度為15.06、30.12、90.36 μg/ml的燈盞乙素對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算質量濃度，以實測值與真實值之比計算回收率。結果，低、中、高質量濃度燈盞乙素對照品溶液的回收率分別為（99.05±4.84）%、（99.58±3.70）%、（100.31±2.27）%，RSD均小于12%（n＝5）。

2.1.4 穩定性試驗 取質量濃度為15.06、30.12、90.36 μg/ml的燈盞乙素對照品溶液，于室溫放置4 h后，進樣測定。結果測定值與0 h的偏差分別為1.79%、1.27%、1.08%（n＝5），表明該對照品溶液在室溫條件下放置4 h穩定。

2.2 燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒的制備

采用復乳-溶劑蒸發法制備燈盞乙素-PEG-PLGA。首先將適量的燈盞乙素溶于水中，取適量體積的燈盞乙素水溶液加入一定體積的有機相中，水浴超聲制得初乳，然后將初乳注入到一定體積的乳化劑水溶液中，超聲20 min得到復乳。將復乳旋轉蒸發，除去全部的有機溶劑，于4 ℃、離心半徑10 cm、16 000 r/min低溫高速離心40 min后，除去上清液，得到燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒。

2.3 指標檢測

采用Zetasizer Nano ZS型納米粒度及Zeta電位分析儀測定所制燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒的粒徑和粒徑分布指數（PDI）。采用高速離心法分離燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒，以甲醇破乳，以納米粒的質量與游離藥物質量進行包封率（ER）的考察[5]，包封率計算公式為ER＝（1－m游/m總）×100%。

2.4 單因素試驗篩選處方

2.4.1 不同有機相對納米粒的影響 以粒徑、PDI、包封率為指標，分別以丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷為有機相，按“2.2”項下方法制備納米粒，考察不同有機相對納米粒的影響。結果顯示，3種有機相所制納米粒的粒徑依次為（73.4±1.2）、（79.6±1.7）、（85.3±3.1）nm，PDI依次為0.102、0.137、0.294，包封率依次為（33.68±1.11）%、（29.12±1.36）%、（21.44±1.75）%，n＝3。這表明采用丙酮制得的納米粒具有較小的粒徑和PDI值，且包封率較高，因此選擇丙酮作為有機相。

2.4.2 內水相與有機相不同比例對納米粒的影響 以粒徑、PDI、包封率為指標，以內水相與有機相比例分別為1∶5、1∶10、1∶15，按“2.2”項下方法制備納米粒，考察不同內水相與有機相比例對納米粒的影響。結果顯示，內水相與有機相3種比例所制納米粒的粒徑依次為（71.1±1.3）、（73.5±1.6）、（75.2±1.9）nm，PDI依次為0.104、0.102、0.199，包封率依次為（33.59±1.21）%、（30.22±1.19）%、（25.36±1.69）%，n＝3。這表明內水相和有機相的比例為1∶5時所制納米粒粒徑較小，包封率較高。雖然比例為1∶10時所制納米粒PDI略低于比例為1∶5時，但綜合考慮，選擇內水相和有機相的比例為1∶5。

2.4.3 不同乳化劑對納米粒的影響 以粒徑、PDI、包封率為指標，以泊洛沙姆、聚山梨酯80和聚山梨酯20為乳化劑，按“2.2”項下方法制備納米粒，考察不同乳化劑對納米粒的影響。結果顯示，3種乳化劑所制納米粒的粒徑依次為（76.4±1.6）、（72.6±1.5）、（78.9±1.8）nm，PDI依次為0.103、0.105、0.176，包封率依次為（34.63±1.25）%、（35.82±1.33）%、（27.25±1.57）%，n＝3。這表明采用聚山梨酯80為乳化劑時所制納米粒具有較小的粒徑和較高的包封率，綜合考慮，選擇聚山梨酯80為乳化劑。

2.4.4 聚山梨酯80不同體積分數對納米粒的影響 以粒徑、PDI、包封率為指標，以聚山梨酯80體積分數分別為0.2%、0.5%、1%，按“2.2”項下方法制備納米粒，考察聚山梨酯80不同體積分數對納米粒的影響。結果顯示，3種體積分數的聚山梨酯80所制納米粒的粒徑依次為（74.5±1.6）、（73.8±1.5）、（75.3±1.9）nm，PDI依次為0.107、0.105、0.110，包封率依次為（32.35±1.28）%、（36.27±1.25）%、（35.96±1.38）%，n＝3。這表明聚山梨酯80體積分數為0.5%時所制納米粒包封率較高，且3種體積分數的聚山梨酯80對納米粒的粒徑和PDI值影響不大，因此聚山梨酯80的體積分數確定為0.5%。

2.4.5 初乳與外水相不同比例對納米粒的影響 以粒徑、PDI、包封率為指標，以初乳與外水相比例分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15，按“2.2”項下方法制備納米粒，考察初乳與外水相不同比例對納米粒的影響。結果顯示，初乳與外水相3種比例所制納米粒的粒徑依次為（76.3±2.1）、（79.4±2.5）、（69.5±2.2）nm，PDI依 次 為0.101、0.126、0.103，包封率依次為（21.36±2.25）%、（33.57±2.67）%、（49.33±2.31）%，n＝3。這表明初乳與外水相的比例為1 ∶15時所制納米粒包封率較高、粒徑較小，因此選擇初乳與外水相的比例為1∶15。

2.4.6 不同質量濃度燈盞乙素對納米粒的影響 以粒徑、PDI、包封率為指標，以燈盞乙素質量濃度分別為5、10、20 mg/ml，按“2.2”項下方法制備納米粒，考察不同質量濃度燈盞乙素對納米粒的影響。結果顯示，3種質量濃度燈盞乙素所制納米粒的粒徑依次為（81.2±2.3）、（76.6±1.8）、（79.2±2.1）nm，PDI依次為0.093、0.095、0.120，包封率依次為（31.59±1.05）%、（47.33±1.17）%、（34.86±2.01）%，n＝3。這表明燈盞乙素質量濃度為10 mg/ml時所制納米粒具有較高的包封率、較小的粒徑。

2.4.7 不同質量濃度PEG-PLGA對納米粒的影響 以粒徑、PDI、包封率為指標，以PEG-PLGA質量濃度分別為5、15、25 mg/ml，按“2.2”項下方法制備納米粒，考察不同質量濃度PEG-PLGA對納米粒的影響。結果顯示，3種質量濃度PEGPLGA所制納米粒的粒徑依次為（81.7±2.9）、（77.5±2.2）、（79.4±2.7）nm，PDI依次為0.131、0.117、0.119，包封率依次為（40.22±1.37）%、（45.76±1.25）%、（42.33±1.28）%，n＝3。這表明PEG-PLGA質量濃度為15 mg/ml時所制納米粒粒徑較小、包封率較高，因此選擇PEG-PLGA質量濃度為15 mg/ml。

2.5 正交試驗優選處方

選取對包封率影響較大的初乳與外水相的比例（A）、燈盞乙素質量濃度（B）、PEG-PLGA質量濃度（C）為因素，以包封率為指標，進行正交試驗優化處方。因素與水平見表1，正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果Tab 2 Result of orthogonal test results and range

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

由表2和表3結果可知，影響包封率的因素依次為A＞B＞C，但相關因素對微乳的影響差異無統計學意義（P＞0.05）。根據試驗結果，選擇最優處方為A2B2C2，即初乳與外水相的比例為1 ∶15，燈盞乙素質量濃度為10 mg/ml，PEG-PLGA質量濃度為15 mg/ml。

2.6 燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒的質量評價

2.6.1 表觀形態 采用透射電鏡觀察納米粒的形貌，結果顯示，燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒為圓形或者橢圓形，粒徑為70～80 nm。燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒的透射電鏡圖見圖1。

2.6.2 粒徑與Zeta電位 試驗結果顯示，燈盞乙素-PEGPLGA載藥納米粒的平均粒徑為（78.54±2.21）nm，Zeta電位為（－23.07±1.39）mV。燈盞乙素-PEG-PLGA納米粒的粒徑分布圖見圖2。

2.6.3 包封率和載藥量測定 試驗結果顯示，燈盞乙素-PEGPLGA載藥納米粒的載藥量為（1.67±0.12）%，包封率為（45.32±1.29）%。

圖1 燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒的透射電鏡圖Fig 1 Transmission electron microscopy figure of scutellarin-PEG-PLGA nanoparticles

圖2 燈盞乙素-PEG-PLGA納米粒的粒徑分布圖Fig 2 Particle size distributions of scutellarin-PEG-PLGA nanoparticles

2.6.4 穩定性考察 將燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒分裝于安瓿瓶中，于4 ℃條件下保存。分別在保存1、2、3個月時取出樣品測定其粒徑和包封率，評價其4 ℃條件下保存的穩定性。結果顯示，在不同時間測定樣品，其粒徑和包封率都無明顯變化，表明燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒在4 ℃條件下，3個月內能保持穩定。

3 討論

目前，臨床上用到的燈盞花素劑型主要為片劑、顆粒劑、注射劑、注射用無菌粉末等[6-7]，此外，也有多種速釋制劑以及緩控釋制劑處于研發階段。由于其理化性質制約著其療效的發揮，各種新型制劑的研發、改善其體內過程以增加其療效，成為燈盞花素藥物研究當中的一個趨勢[8-9]。

PEG-PLGA是以聚乙醇酸和聚乳酸聚合而成，其核心成分為PLGA，聚乳酸親水性較差、降解較慢，而聚乙醇酸則親水性較好、降解較快，兩者結合在一起有利于完善其化學性質，可對藥物產生較強的保護作用，且具有較強的靶向性[10-11]。將燈盞乙素制備成燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒有利于其被巨噬細胞吞噬到達網狀內皮系統，延緩藥物的釋放，且可以使藥物在腸道停留時間延長，增加其吸收；此外，有利于保護藥物，減少胃酸對其破壞，提高藥物的體內穩定性，有利于提高藥物的透膜能力。目前，PEG-PLGA被公認為一種良好的生物可降解材料，廣泛應用于藥物新劑型的設計。

本試驗制備燈盞乙素-PEG-PLGA載藥納米粒的工藝簡單、制劑穩定性好，有利于實現燈盞乙素體內的長效循環以及增加其透過血腦屏障的量。后續將進一步對其體內外特征進行研究，為燈盞乙素新劑型的開發和臨床使用提供參考。

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