骨髓間充質干細胞治療血管性癡呆大鼠行為學及海馬CaM、CaMKⅡ表達水平的影響

井 沆，田 茂，董艷軍，官志忠，2，肖 雁

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是老年期癡呆的主要類型之一，是由一系列腦血管因素(腦組織梗死、低灌注或出血等)導致腦組織損害引起的以認知功能障礙為特征的綜合征［1］。隨著人口老齡化和腦血管疾病發病率的上升，VaD 的發病率也逐年上升。因此，為VaD 患者提供有效地治療是亟待解決的問題。近期研究已發現，鈣通道及其相關信號的改變與VaD 的發生密切相關［2］，可能是引起學習記憶能力下降的主要因素。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年健康SD 大鼠60 只，購自貴陽醫學院動物研究中心［合格證號:SCXK (黔)200220001］。體重200～250 g，雌雄各半;4 周齡清潔級SD 雄性大鼠2 只(BMSCs 分離培養用)，自由飲食。

1.1.2 試劑 胎牛血清、低糖DMEM 培養基、0.25% 胰蛋白酶液購于HyClone 公司。CD90、CD29、CD44、CD45 流式檢測抗體購自BD 公司。BHA、BFGF 購于美國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs 的原代分離培養 取4 周齡健康SD 雄性大鼠，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，無菌條件取兩側股骨及脛骨，PBS 清洗3 次，用添加青-鏈霉素的L-DMEM 培養基沖洗骨髓腔，反復吹打，將沖出的骨髓制成單細胞懸液，1000 r/m 離心10 min，棄上清，加入事先配好的15%FBS的培養液，吹打均勻接種于25 cm2的培養瓶中，置37 ℃、5%CO2濕度培養箱中進行培養。

1.2.2 BMSCs 的純化傳代及鑒定 取P5 代已純化的BMSCs，0.25% 胰蛋白酶消化，4 ℃離心，1000 r/m，10 min，用PBS 清洗細胞3 次，各管分別加入流式檢測單克隆抗體CD90、CD29、CD44、CD45，同時每管樣品設立獨立同型陰性對照，于流式細胞儀進行鑒定分析。

1.2.3 BMSCs 的誘導鑒定和標記 選擇第3代BMSCs，加入含10 ng/ml bFGF 的L-DMEM(10%FBS)預誘導24 h，更換培養液，PBS 洗3 次，再加入含200 μmol/L BHA，2%DMSO 的無血清DMEM 誘導5 h，用95% 乙醇固定40 min，PBS 洗5 次×3 min，加入3%H2O2室溫避光孵育15 min，PBS 洗3次×3 min，各孔加入100 μl NSE、Nestin 一抗，4 ℃孵育過夜，對固定的細胞進行免疫組化鑒定分析，具體步驟按照免疫組化試劑盒進行。誘導后的BMSCs 于移植前24 h 在其培養液中加入BrdU，使其濃度為10 μmol/L，繼續培養48 h，離心收集標記后的BMSCs，備用。

1.2.4 VaD 模型的制備 適應性喂養1 w 后，隨機分為模型組和對照組。大鼠術前12 h 禁食，4 h 禁水，改良四血管法進行VaD 模型復制;對照組12 只，只分離椎動脈和頸總動脈，不進椎動脈凝閉和夾閉。

1.2.5 學習記憶能力測定 造模后約一個月用Morris 水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力，進行Morris 水迷宮定向航行實驗和空間探索實驗，第1～4 天進行定向航行試驗:每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序從各入水點靠池壁放入水中，記錄60 s 內大鼠從入水到爬上平臺(固定于第Ⅳ象限)所需時間即逃避潛伏期。每只大鼠每天訓練4 次。第5 天撤去平臺，進行空間探索實驗:記錄大鼠第一次穿越平臺區域的時間以及60 s 內總的穿越平臺區域次數。將符合VaD 標準的27 只大鼠通過隨機數字表法隨機分為兩組:(1)模型組(n=12)，側腦室注射1 ml DMEM 基礎培養液;(2)BMSCs 組(n=15)，側腦室注射移植BMSCs 密度為1 ×106，1 ml，以1 μl/min 的速度勻速注射;移植4 w 后，模型組死亡6 只，存活6 只，BMSCs 治療組死亡2 只，存活13只。另對照組死亡5 只，存活7 只。

1.2.6 Morris 水迷宮認知功能檢測 BMSCs移植4 w 后，通過Moris 水迷宮實驗檢測大鼠的空間學習和記憶能力，方法同上。

1.2.7 海馬鈣調蛋白(calmodulin，CaM)及鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseII，CaMKⅡ)mRNA 表達水平 取海馬組織加入組織裂解液制備10%組織勻漿。采用Trizol 一步法提取實驗鼠海馬組織總RNA，取3 μg RNA 樣品逆轉錄cDNA，以cDNA 為模版擴增CaM、CaMKⅡ和β-actin 基因。CaM 引物序列，上游:3’-GAACCCAACAGAGGCTGAACT-5’，下 游:5 ’ -CACGGATTTCTTCTTCGCTATC-3’，片段長度137 bp;CaMK Ⅱ引物序列，上游:3’-AATGCCAGGAGGAAACTGAAG-5’，下游:5’-ATGGTGGTGTTGGTGCTCTC-3’，片段長度134 bp;β-actin 引物序列，上游:3’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-5’，下游:5’-ACCCTCATAGATGGGCACAG-3’，片段長度115 bp。ABI Step One Plus 型實時熒光定量PCR 儀采集CaM、CaMKⅡ及內參β-actin 擴增各循環熒光信號，以SDS1.4 軟件(Applied Biosystems)進行熒光收集和資料分析。SDS1.4 軟件分析其△△Ct 值及RQ(relative quantity)值，RQ=2-△△Ct。分析實驗結果時以β-actin為內對照，計算各種基因的相對表達水平。

1.2.8 海馬CaMKⅡ蛋白表達 蛋白提取并定量，Western-blot 檢測CaMKⅡ蛋白表達。Western blot 結果用GDS-8000 型UVP 凝膠成像系統照像，以Labworks 軟件分析結果時以β-actin 蛋白條帶作為內參照，計算CaMKⅡ蛋白條帶與β-actin 蛋白條帶像素灰度的百分比值作為CaMKⅡ基因蛋白質表達的相對水平。

1.2.9 統計學方法 采用SPSS 13.0 統計分析軟件，數據以均數±標準差()表示，組間比較采用單因素方差分析或非參數檢驗，P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Morris 水迷宮行為學測試結果 對照組、模型組和BMSCs 組移植后30 d，進行Morris 水迷宮行為學測試。模型組大鼠平均逃避潛伏期明顯長于對照組(P ＜0.05)，表明VaD 模型大鼠定向航行能力降低。第5 天觀察空間探索能力，移走平臺，以在原平臺象限(第1 象限)的活動時間為指標，發現與對照組比較，模型組和BMSCs 組第一次穿越平臺所用時間延長(P ＜0.05)，穿越站臺次數明顯減少(P ＜0.05)。表明VaD大鼠學習能力降低。而模型組與BMSCs 組相比，BMSCs 組逃避潛伏期明顯縮短，第一次穿越平臺時間減少，穿越平臺次數增加(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 海馬CaM、CaMKⅡmRNA 及海馬CaMKⅡ蛋白表達水平 用Real-time PCR 方法檢測到對照組、模型組和BMSCs 細胞治療組3 組中，模型組和BMSCs 細胞治療組海馬CaM 與CaMKⅡmRNA表達水平都較對照組明顯增高(P ＜0.01)，而BMSCs 治療后海馬CaM 與CaMKⅡmRNA 表達水平較模型對照組降低(P ＜0.05)(見圖1)。

2.3 海馬CaMKⅡ蛋白表達水平 與對照組相比模型組和干細胞治療組CaMKⅡ表達水平明顯增高(P ＜0.01)，而干細胞治療后CaMKⅡ表達水平較模型對照組降低(P ＜0.05)(見圖2)。

表1 對照組、模型組和BMSCs 組大鼠定向航行實驗及空間探索實驗結果的比較()

表1 對照組、模型組和BMSCs 組大鼠定向航行實驗及空間探索實驗結果的比較()

與對照組比較* P ＜0.05;與模型組比較#P ＜0.05

圖1 CaM、CaMKⅡmRNA 表達水平

圖2 海馬CaMKⅡ蛋白表達水平

3 討論

在VaD 的發病機制中，鈣超載被認為是VaD 發病機制中一個重要致病因素，但是鈣超載在VaD 記憶和認知功能低下的機制尚未闡明清楚。近期研究已發現，鈣通道及其相關信號的改變與VaD 的發生密切相關［2］，可能是引起學習記憶能力下降的主要因素。在VaD 患者中往往由于腦組織的缺血缺氧造成大量鈣離子的內流，然后通過激活內質網、線粒體鈣通道、使鈣離子大量釋放進入細胞質，從而導致鈣離子超載，鈣穩態平衡被破壞，過量的鈣離子通過激活一系列的鈣依賴性酶促反應從而促進了神經元細胞的凋亡［3，4］。

Ca2+通過與細胞內的受體主要是CaM 相結合，使CaM 構象發生變化，作用于鈣調蛋白依賴性激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase，CaMK)，然后再作用于下游的信號分子［5］。CaMKⅡ在動物的Ca2+/CaM 介導的信號系統中起著重要作用。當Ca2+內流時能夠使CaMKⅡ磷酸化而被激活，活化的CaMKⅡ自身磷酸化，而且當Ca2+下降后CaMKⅡ的活性仍能保持其狀態，推測CaMKⅡ可能是記憶的分子開關，在誘導長時程增強(long-term potentiation，LTP)的過程中起著關鍵的作用［6］。海馬被認為與空間記憶功能障礙密切相關［7］，特別是與年齡相關性認知功能損害有關［8］。本研究通過對對照組、模型組和BMSCs 細胞治療組大鼠的海馬組織內CaM、CaMKⅡmRNA 和蛋白表達水平均進行了檢測，結果顯示，BMSCs 組和模型組海馬組織CaM mRNA、CaMKⅡmRNA 和CaMKⅡ蛋白表達均顯著高于對照組，并且與行為學上的變化相一致。而BMSCs 治療后，上述指標降低，說明由于缺血所引起的鈣超載從而導致海馬組織CaM 和CaMKⅡ表達增高，在側腦室內移植經誘導的BMSCs 后，可能通過降低與鈣信號相關的CaM 和CaMKⅡ等的表達，來緩解缺血引起的神經元損傷，從而改善VaD 鼠的認知功能。

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［5］Zhao Y，Yang H，Meng K，et al.Probing the Ca2+/CaM-induced secondary structural and conformational changes in calcineurin［J］.Int J Biol Macromol，2014，64:453 -457.

［6］Zeng S，Holmes WR.The effect of Noise on CaMKⅡactivation in a dendritic spine during LTP induction［J］.J Neurophysiol，2010，103(4):1798 -1808.

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